高活性发酵豆粕生产菌株筛选及其最佳发酵条件的研究--科研立项网

StudiesonSereeningHighActivityStrainsandTheBestFermentationConditionsforSoybeanMealFermentation

摘要

本论文以自然界中选育出的一株兼性厌氧条件下高产蛋白酶的枯草芽抱杆菌NCU646(Bacillus)作为主要发酵菌株，结合本实验室保藏菌酿酒酵母NCU223(Saeeharomyeeseerevssjae)和植物乳酸杆菌 NCU116(lactobacillus)固态发酵豆粕以提高豆粕的饲用品质。本论文采用了不同固态发酵方法进行发酵豆粕研究，获得了发酵豆粕最佳工艺条件。本文主要进行了以下研究:

(1)豆粕发酵专用菌种选育技术的研究。分别对中外发酵豆粕、霉豆腐、酱油发酵原液等进行了厌氧条件下高产蛋白酶生产菌株的筛选。得到了高效发酵豆粕且性能稳定的优势菌株NCU646。经过生理生化鉴定和分子生物学鉴定，鉴定NCU646为兼性厌氧型枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。

(2)NCU646固态发酵豆粕工艺的研究。通过L₉(3⁴)正交试验优化发酵条件，得出NCU646单菌发酵豆粕的最佳发酵工艺条件为:NCU646的接种量(菌悬液培养到生长对数中期的质量)为6.0g/100g，料水比 1:0.8，发酵温度为36℃，发酵时间为96h。在最佳发酵条件下，发酵后豆粕中总蛋白含量达到52.26%，小肤含量为发酵前的8.56倍达到14.55%，豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量从25.0mg·100g^-1降解到饲料标准规定含量以下的0.28mg·100g^-1。

(3)混菌固态发酵豆粕工艺的研究。利用枯草芽袍杆菌NCU646、酿酒酵母NCU223和植物乳酸杆菌 NCU116进行混合发酵豆粕。分别进行了一步法发酵豆粕和二步法发酵豆粕的工艺研究。

一步法发酵工艺:NCU646:酿酒酵母NCU223:植物乳酸杆菌 NCU116=2:1:1(各菌悬液培养到生长对数中期的质量比)，接种量为6.0g/100g(三种菌悬液培养到生长对数中期时按质量比2:1:1的总质量为6.0g)，料水比1:0.8，发酵温度为36℃，发酵时间为96h。豆粕发酵后总蛋白达到53.51%，小肤含量达到13.20%，有机酸含量达到2.19%，干样pH值由6.89下降到5.32，胰蛋白酶抑制因子从25.0mg·100g^-1降解到0.28mg·100g^-1。

二步法发酵工艺:NCU646:酿酒酵母NCU223:植物乳酸杆菌NCU116=2:1:1(各菌悬液培养到生长对数中期的质量比)，接种量8.0g/100g(三种菌悬液培养到生长对数中期时按质量比 2:1:1的总质量为8.0g)，料水比1:0.8，第一步在温度为30℃下接入枯草芽抱杆菌和酿酒酵母发酵豆粕，发酵时间为72h；第二步在温度为36℃下接入植物乳酸杆菌到第一步发酵豆粕中，发酵时间为48h。豆粕发酵后总蛋白达54.49%，小肤含量达到15.38%，有机酸含量达到2.09%，干样pH值由6.89下降到5.42，胰蛋白酶抑制因子从25.0mg·100g^-1降解到o.18mg·100g^-1。

(4)诱变NCU646选育高活性发酵豆粕优良菌种的研究。利用化学诱变剂亚基肌复合紫外线照射对NCU646进行诱变处理，得到突变菌NCU656。利用正交试验方法对NCU656结合酿酒酵母NCU223和植物乳酸菌NCUll6一步法固态发酵豆粕的工艺进行研究。得到一步法最佳工艺为:NCU656:酿酒酵母CU223:植物乳酸杆菌 NCUI16=3:2:1，接种量为4.0g/100g，料水比1:0.8，发酵温度为36℃，发酵时间为120h。在该发酵条件下，发酵豆粕中总蛋白达到54.33%，小肤含量达到14.68%，干样pH值由6.89降为5.34，有机酸含量达到2.15%，胰蛋白酶抑制因子降解为0.24mg·100g^-1；利用正交试验方法对NCU656混合酿酒酵母NCU223和植物乳酸菌NCU116二步法固态发酵豆粕的工艺进行了研究。得到二步法最佳工艺为:NCU656:酿酒酵母NCU223:植物乳酸杆菌NCUll6=2:1:1，接种量为8.09/1009，料水比1:0.8，第一步在温度为30℃下接入枯草芽抱杆菌和酿酒酵母发酵发酵豆粕，发酵时间为72h；第二步在温度为36℃下接入植物乳酸杆菌到第一步发酵后豆粕中，发酵时间为48h。在该发酵条件下，发酵豆粕中总蛋白达54.39%，小肤含量达到17.01%，有机酸含量达到2.10%，干样pH值由6.89降到5.44。胰蛋白酶抑制因子降解到0.13mg·100g^-1。

第2章豆粕发酵产蛋白酶专用菌种选育

2.2方法

2.2.1发酵豆粕高产蛋白酶菌种的筛选

2.2.1.1初筛

在超净台中将中外发酵豆粕、霉豆腐和酱油原液分别取10.0g，置于带有玻璃珠盛有90.0ml生理盐水的三角瓶中，振摇约 20min，分别使样品与生理盐水充分混合，使细胞分散。用无菌移液枪吸取 1.0ml样品悬液加到盛有 9.0ml生理盐水的大试管中充分混匀，此为原液10^-1梯度稀释液，以此类推制备成10^-²~10^-9不等的几种稀释度样品液。将上述梯度稀释的样品液分别涂布于对应的选择培养基上。每种梯度浓度稀释液在相应选择培养基上涂布3皿平板并标一记。PDA双层酪蛋白选择培养基平板置于30℃，其他的平板置于36℃厌氧培养箱中分别进行培养1-3d并观察。能在选择培养基中生长并产生透明水解圈的菌株表明其具有分解豆粕粗蛋白为小肤的能力。根据水解圈直径(D₁)与菌落直径(D₂)的比值(D₁/D₂)大小说明水解圈越大者其降解粗蛋白能力越强。选择蛋白水解圈最大的10株菌株进行编号保存。

2.2.1.2菌落特征观察

保存的10株纯化后的菌株进行相应培养基的点接培养观察。肉眼分别观察菌落形状、颜色、表面质地，菌落边缘等菌落特征，测量菌落和水解蛋白圈直径。

2.2.1.3蛋白酶酶活的测定[78]

蛋白酶活力的测定方法:采用SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法。

2.2.1.4复筛

复筛的流程为:

为验证初筛选菌株产酶能力的大小，进行了豆粕固态发酵试验。发酵豆粕的总蛋白含量的测定采用国家标准GB/T6432- 1994[79]的凯氏定氮法。

，如下:

①试剂

质量浓度40%氢氧化钠:称取分析纯氢氧化钠800.0g用蒸馏水定容至2000ml。

b0.olN盐酸标准溶液标定:量取0.gml盐酸，缓慢注入IOO0ml水。精确称取在105’C烘箱中烘至恒重的无水碳酸钠0.2479加入新煮沸冷却后的蒸馏水SO00ml定容。用嗅甲酚绿一甲基红混合指示剂，进行滴定标定盐酸浓度。。溟甲酚绿一甲基红混合液为指示剂

②仪器

aIO0ml消化管和Z000W消化炉 bk05A自动定氮仪 cIOOml酸式滴定管

③测量操作a样品处理:精密称取2.09发酵豆粕样品移入干燥的100ml消化管中，加入0.29硫酸铜，6.09硫酸钾及20.oml浓硫酸，于300℃消化炉中将内容物全部l3

炭化至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。b将消化好的样品移到k05A自动定氮仪上进行蒸馏操作至消化管中溶液变为黑色止。c以标定摩尔浓度的标准盐酸溶液对蒸馏好的消化管中蒸馏液进行滴定，以漠甲酚绿一甲基红混合液为指示剂进行滴定指示。

④计算:(Ul一犷2)xN只 0.014m又F火100%X:样品中蛋白质的百分含量，%；VI:样品消耗盐酸标准液的体积，ml；VZ:试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；N:盐酸标准溶液的当量浓度；0.014:IN盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m:样品的质量名；F:氮换算成总蛋白的系数6.25。

(2)小肤含量的测定方法

为国家饲料大豆肤粉标准QB/T2653-2004[80]，

2.2.2鉴定

2.2.2.1形态鉴定

(1) 将最优发酵菌种NCU646菌种进行菌种纯化，对其进行菌落和菌体的形态和培养特征的观察。

(2) 菌体形态观察:进行革兰氏染色[82]后，油镜下察菌体的大小、形状及其特殊构造。

革兰氏染色方法如下:

2.2.2.2NCU646的生理生化特征鉴定[82]

将菌株NCU646进行一系列生理生化试验，对其加以鉴别。

淀粉水解试验

实验材料与试剂:①.淀粉培养基:可溶性淀粉，KNO₃，NaCI，KZHPO₄，MgSO₄·7HZo，琼脂。②.碘液:碘片lg，KIZg，蒸馏水30oml.先用3-sml溶解Kl，再加碘融化补足水分至3O0ml。③.器皿接种针，平皿，培养箱。

2.2.2.3芽抱检测试验[83]

由于芽抱内具有耐热酶，采用加热煮沸法检测细胞内是否存在芽抱。在沸水中加热不同时间，最后对菌液涂布平板进行菌落数的统计。

2.2.2.4 16SrRNA分子生物学鉴定[84]

将筛选出的性能最优菌株送至中国科学院微生物研究所菌种鉴定中心进行分子生物学鉴定。

第3章枯草芽抱杆菌NCU646固态发酵豆粕的工艺研究

3.1.6实验方法

3.1.6.1菌种保存及培养

枯草芽抱杆菌NCU646采用牛肉膏蛋白陈培养基斜面保存。菌悬液培养基采用牛肉膏蛋白陈液体培养基。

3.1.6.2固态发酵设计

枯草芽抱杆菌NCU646发酵豆粕的试验流程:

3.1.6.3

NCU646菌悬液的制备[85]

制备1000ml牛肉膏蛋白陈液体培养基平均分装于10个250ml的三角瓶中，每个三角瓶中分装培养液100ml。将保存在斜面培养基上的枯草芽抱杆菌NCU646 (Baoillus subtilis)用接种环每瓶接种2-3环菌泥到各个三角瓶中，密封瓶盖，接种好的三角瓶置于36℃、120r/min的摇床中进行菌悬液的培养，直到生长对数中期为止。

3.1.6.4NCU646菌悬液的生长对数中期的确定

采用分光光度计比浊法[86]在波长600nm下所测的OD值测定Ncu646菌悬液的生长曲线得出生长对数中期的培养时间。在600nm下，NCU646菌悬液中的细胞浓度与透光度成反比，与光密度(OD值)成正比。先制作样品的标准曲线，再以未接种的牛肉膏蛋白陈液体培养基为空白对照，进行样品OD值的测定，准确反映出NCU646培养液中枯草芽抱杆生长趋势。绘制生长曲线，确定NCU646液体培养的对数生长中期。

操作如下:

①标记取19支无菌试管，标记培养时间，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34和36h。

②接种用灭菌吸管吸取10ml培养了10-12h的枯草芽抱杆菌菌悬液转入盛有200ml牛肉膏蛋白陈细菌培养液的三角瓶中，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标一记的无菌试管中。

③培养将已接种的试管置于摇床36℃摇床(180r/min)中，分别培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34和36h，将标有相应的时间的试管取出，置于冰箱中储存，最后一同检测光密度。

④比浊测定用未接种的细菌培养液作为空白对照，选用600nm波长进行测定。对培养液进行适当的稀释，使其光密度值保持在0.1-0.65之间。

⑤绘制生长曲线以培养时间为横坐标，以所测定的OD值为纵坐标绘制枯草芽抱杆菌的生长曲线。

⑥试验重复三次。

3.1.6.5总蛋白含量的测定采用国家标准GB/T6432-1994的凯氏定氮法

采用国家标准GB/T6432- 1994的凯氏定氮法，操作步骤同实验2.2.1.4。

3.1.6.6小肤含量的测定

测定方法为国家饲料大豆肚粉标准QB/T2653-2004，操作步骤同实验2.2.1.5。

3.1.6.7大豆胰蛋白酶抑制因子活性测定

分光光度法[87]，

第4章混菌固态发酵豆粕的工艺研究

4.1.6混菌固态发酵豆粕的工艺优化

4.1.6.1一步法发酵豆粕的工艺流程

将枯草芽抱杆菌NCU646、植物乳酸杆菌和酿酒酵母一次性接入到豆粕发酵基中，利用正交试验原理优化影响发酵过程的各因素条件。观察一记录发酵过程中物料的颜色、气味和粘度，对发酵豆粕中的总蛋白质、小肤、有机酸、pH、胰蛋白酶抑制因子质量含量等进行检测，最后得出一步法发酵豆粕的最佳工艺。

4.1.6.2二步法发酵豆粕的工艺流程

流程

将生长对数中期的NCU646和酿酒酵母NCU223先接入豆粕发酵基中，30℃条件下发酵一段时间，然后接入生长对数中期的植物乳酸杆菌，在36℃条件下厌氧条件下继续发酵一段时间直到结束发酵。观察记录发酵过程中发酵基的颜色、气味和粘度变化，对发酵豆粕中的总蛋白质、小肤、有机酸、pH、胰蛋白酶抑制因子质量含量等进行检测，得出二步法发酵豆粕的最佳工艺。

4.1.7总蛋白质量含量的测定同

2.2.1.4中实验(1)。

4.1.8小肤质量含量的测定同

2.2.1.4中实验(2)。

4.1.9大豆胰蛋白酶抑制因子含量测定

同实验

4.1.10

有机酸含量的测定.

10.1有机酸含量的测定方法[92]

取发酵豆粕鲜15.0g置于150ml烧杯中加入100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min，离心10min(3000r/min)，汲取上清液15.0ml，然后加30.0ml去离子水和2-3滴酚酞指示剂，用 0.1mol/LNaOH标准溶液滴定，滴定到溶液呈现粉红，记录消耗NaOH体积。

计算公式:

鲜样有机酸(%)=

NxVx0.09008x115

15x15

N:NaOH标准溶液的浓度；

V:消耗NaOH标准溶液体积；

0.09008:乳酸的毫克当量。

第4章混菌固态发酵豆粕的工艺研究

4.1.12发酵菌种生长曲线的测定

微生物培养过程中的生长曲线一般分为迟滞期、对数期、恒定期、衰亡期。在进行接种试验时一般是将菌种的液体培养的生长对数期中期的菌液接入到发酵基中，所以十分必要对发酵菌种的生长曲线进行研究。

4.1.12.1酿酒酵母生长曲线的测定

由于酿酒酵母菌细胞大，沉降速度快，如果用光电比色计测定菌悬液的光密度(OD值)来推知菌液的浓度就不易准确。因此，本实验对酿酒酵母进行生长曲线的确定时，采用血球计数法[94]在显微镜下直接计数来测定液体培养酿酒酵母时酿酒酵母的菌数增长数。操作方法配制100ml麦芽汁液体种子培养基，装到1个150ml三角烧瓶中，灭菌后从斜面试管中接入酿酒酵母，于30℃恒温培养箱中静置培养12h。