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妇科补肾养血保胎方对先兆流产大鼠免疫细胞因子及凝血功能的影响
添加时间: 2021/7/25 13:40:40 来源: 作者: 点击数:

报告正文

一、立项依据与研究内容

(一)项目的立项依据

近年来,随着工作学习压力的不断增加及社会、生活环境的改变,先兆流产的发病率逐年升高[1],不但损害了患者的身心健康,而且还增加了反复流产的机率,因此,有效防治先兆流产,凸显临床研究价值。针对病因,西医采取了药物、手术等治疗手段,治疗取得一定效果,但是结果不甚满意,医学界普遍认识到中医药治疗本病的潜在优势,从而对中药治疗本病独特的机理进行广泛的研究。随着科学进步,科学家发现母体细胞因子在人类的妊娠过程中起重要作用,贯穿胚[2]胎植入到分娩的全过程。目前大多数学者将Th1/Th2型细胞因子介导的免疫反应描述为Th1型免疫反应和Th2型免疫反应。细胞因子在病理妊娠丢失中有着重要作用。Th1细胞因子一般对妊娠有害,而Th2细胞因子能维持妊娠起着积极作用。两者之间的平衡在维持正常妊娠方面起着重要的作用。平衡一旦被打破,将导致流产的发生。中医药用于保胎治疗已有几千年的历史,近年来随着细胞因子与先兆流产关系研究的深入,现代各专家对先兆流产进行了辨证论治、专方专药、辨证与辨病相结合的研究,安胎后代的追踪以及对安胎机理的实验研究。中医药作用机理一部分因素是否是通过细胞因子引起的免疫应答也成了研究的热门内容。中医把先兆流产定义为“胎漏”“胎动不安”,历代医家重视对胎漏、胎动不安的研究。早在汉代《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治》就提出安胎养胎的当归散和白术散,分别代表了一热一寒的安胎方。明代《景岳全书·妇人规》强调辨证论治安胎,并首先提出了动态观察“腹痛、下血、腰酸、下坠”胎动不安四大症状的轻重变化,预测胚胎存活与否,以决定安胎抑或下胎,完善了相关妊娠病“治病与安胎并举”和“下胎”两大治则。现代中医多认为导致胎动不安、胎漏的主要病机是冲任损伤、胎元不固。常见的病因病机有肾虚、血热、气血虚弱和血瘀。

妇科补肾养血保胎方是丁氏妇科第十代传人、全国第六批老中医药专家学术继承指导老师丁丽仙教授多年治疗先兆流产的经验方,临床疗效显著妇科补肾养血保胎方由党参、黄芪、炒白术、白芍、桑寄生、菟丝子、杜仲、续断、阿胶珠、砂仁、仙鹤草等组成,是丁氏妇科第十代传人丁丽仙教授安胎经验方,主治因先天禀赋不足、或孕后不节房事、或房劳多产、或大病久病等所致肾气亏损、气血两虚、冲任不固之先兆流产。《素问》曰:“肾者,......精之处也”,“夫精者,身之本也”,“生之来,谓之精”。肾藏精,主生长发育和生殖,肾所藏之精,有先天、后天之分,先天之精是构成生命的本原,形成胚胎的重要物质,是人体生长发育生殖的物质基础;先天之精依赖后天之精的充养而日渐充盛,以充分发挥其生理效应。胞宫主孕育胎儿,冲为血海,任主胞胎,冲任之本在肾,《妇人规·胎漏篇》说“冲任之本在肾,如肾气不盛,则冲任不固”“胞络者,系于肾”肾精肾气充盛,胞胎稳固。《傅青主女科》说:“脾健则血旺而荫胎”,此为补肾养血保胎方的组方依据。其中党参、黄芪、炒白术、甘草,健脾益气、养血安胎;桑寄生、菟丝子、枸杞、续断、杜仲补肾气益精血、固摄冲任;阿胶珠补血安胎;砂仁和胃理气安胎;仙鹤草收敛止血;白芍养血柔肝,合甘草,缓急止痛。全方脾肾双补,益精养血,气血足则胎自安。现代药理研究表明,菟丝子增加大鼠腺垂体、卵巢、子宫脏器重量,提高HCG、黄体生成素LH受体功能,改善生殖内分泌[6]。黄芪可提高免疫球蛋白、促进抗体产生,增强T淋巴细胞,对免疫功能有双向的调节作用,能恢复紊乱的免疫机能[7]。川续断、菟丝子、桑寄生、阿胶珠合用可上调IL-4、IL-10细胞因子含量,下调IL-2、IFN-γ水平,调整Thl/Th2细胞的失衡[8]

《妇人大全良方·胎动不安方论》有云:“妊娠下血,?6?7?6?7食少气倦,此气虚不能摄血也”。妇女孕后,素体阴虚,阴血养胎,肾精愈亏,心肝失养,肝血亏损,肝阳上亢,冲任失调,胎气受损,则引起胎漏、胎动不安;或者妇女情志不遂,久郁伤肝,肝气不舒,肝郁化火,热从内生,迫血外溢,亦能导致木克脾土,脾气虚弱,统摄无权,冲任不固,阴血溢出于胞宫,均会导致胎漏、胎动不安的发生。《傅青主女科》曰:“夫养胎半系于肾水,然非肝相助,则肾水实有独立难支之势,故保胎必滋肾水,而肝血断不可不顾。”胎漏、胎动不安既有单一的病机,又常有脏腑、气血、经络同病,虚实错杂的复合病机,现代医家结合自己经验的同时多动态观察病机的兼夹及其变化。褚玉[2]霞教授在临床上以在“禇氏安胎方”为基本方加减治疗先兆流产,临床效果显著。若为子宫畸形或免疫因素引起先兆流产,临床也按脾肾亏虚论治;若为感染因索所致,则应在固肾培脾的基础上重用清热安胎之品,如二花、知母、公英等;若为母儿血型不合所致,则在“禇氏安胎方”的基础上加龙胆草、茵陈、栀子。[3]杨氏等根据名老中医门成福临床经验,将胎漏、胎动不安分3型:阴虚血热型,以养阴清热为治则,方药用寿胎丸加生地炭、地榆炭、黄芩、麦冬等。肾精亏虚型,补肾填精为治则,用寿胎丸加党参、陈皮、砂仁、白术、黄芩等。外伤胎元型,用圣愈汤加减,方药为:太子参、黄芪、当归、川芎、川续断、砂仁、菟丝[4]子、桑寄生、熟地黄、白芍、杜仲、三七粉。

羟基脲能明显抑制核苷酸的代谢,使蛋白质代谢发生相应的改变,产生虚损症状,如体重、体温下降、体毛枯稿、活动迟缓、萎靡、生殖机能减退等肾虚症状,并出现脏器重量减轻 [9]。米非司酮争夺孕激素受体,无孕激素支持故蜕膜变性坏死,导致发生先兆流产。研究表明:肾虚流产模型造模成功,模型组体重增长缓慢、胚胎发育不良,或胚胎丢失;保胎方可增加大鼠体重、子宫卵巢重量,对抗羟基脲所致核苷酸、蛋白质代谢异常的虚损症状,降低流产率,与保胎灵组相当。

Thl细胞主要分泌IFN-γ、IL-2等,间接或直接激活巨噬细胞、T淋巴细胞及NK细胞等多种毒性细胞,损伤胚胎滋养细胞而影响胚胎发育生长。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL- 10 等引起较强的抗体反应,并介导体液免疫,对妊娠有利。常态下,Thl/Th2网络维持着动态平衡[10]。正常妊娠中Thl/Th2型细胞应答出现生理性失衡,Th2型细胞因子占优势;当该平衡由Th2向Thl发生偏移时,滋养细胞和胎儿受损,导致流产的发生[11]。研究发现流产鼠胎盘部位分泌的IFN-r、IL-2浓度高,IL-4, IL-10浓度低,混合淋巴细胞胎盘反应中产生的IL - 2提高了2.5倍、IFN-γ提高了55倍,证实Thl型细胞因子可直接破坏胎盘滋养细胞的生长,对胚胎的着床、发育和胎儿生存产生不良影响[12]Chaouat [13]等研究认为IL4/IFN-γ是衡量Th1/Th2型免疫平衡的最佳客观指标,试验中模型组的该指标低于对照组和中药干预组,提示保胎方的安胎机制可能与调节母-胎界面局部Th1/Th2 型细胞因子的表达有关,可能是直接调控Th1 /Th2 型细胞因子的表达,也可能为通过提高P的水平间接调节Th1/Th2 型细胞因子的表达,进而改变流产模型母胎界面Th1 /Th2 型免疫平衡,形成Th2 型免疫偏离,诱导母胎免疫耐受,维持正常妊娠。保胎方可抑制Th1细胞因子分泌,增加Th2型细胞因子的含量,纠正Th1 /Th2的比值,降低胚胎源于母体的免疫排斥而达安胎作用。此实验结果可能与方中菟丝子、桑寄生、川续断、阿胶珠等调节免疫因子的药理作用有关。

凝血功能指标PT缩短及Fbg的升高表明机体凝血机能亢进,Fbg异常升高反应血栓风险形成[14] PT、Fbg是诊断出血性疾病的主要指标。凝血功能增强是妊娠期的生理现象,凝血与纤溶过程,为胚胎着床、滋养细胞侵入及胎盘形成起重要作用。实验中,治疗各组PT时间均有延长,提示保胎方可延长PT,降低血液的粘度。血浆中含量最高的凝血因子为血浆纤维蛋白原,在凝血过程中,形成纤维网与血液有形成分共同组成血块,当凝血、抗凝血、纤溶系统失衡,致螺旋动脉血管病变,多发性胎盘血栓形成,胚胎缺血缺氧,缺氧性细胞损伤,导致先兆流产[16]。研究结果示:保胎方、保胎灵均可延长PT,降低Fbg含量,缓解血液高凝状态发挥保胎作用。此实验结果可能砂仁的抗血栓形成的药理作用有关。妇科补肾养血保胎方能改善羟基脲所致肾虚流产大鼠模型一般情况、提高体重及子宫卵巢重量、减轻对胚胎与子宫损伤的作用;可通过降低Th1细胞因子浓度,提高Th2细胞因子浓度,调整Th2/Th1的比值偏向Th2,改善母体对胚胎的免疫排斥作用;可通过延长PT、降低Fbg含量,降低血粘度发挥安胎作用。

(二)项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。

.主要研究内容

采用肾虚先兆流产大鼠模型,随机分为保胎方高、中、低剂量组、模型对照组、保胎灵对照组,药物干预10天,另设空白对照组。用酶联免疫法(ELISA)检测血清Thl型细胞因子(IFN-γ, IL-2)Th2型细胞因子(IL-4, IL-10)、凝血功能指标(PTFbg),观察各组体重、子宫卵巢形态、胚胎数的变化。

实验以早孕大鼠为研究对象,用米非司酮复制先兆流产大鼠模型。妊娠第1天随机将大鼠分为5组:将实验动物随机分成正常妊娠组(简称正常组)、模型对照组(简称模型组)、褚氏安胎方高剂量组(简称高剂量组)、褚氏安胎方低剂量组(简称低剂量组),黄体酮对照组(简称黄体酮组),每组12只。同种饲养条件下,分笼喂养。从妊娠第1天各组每日定时灌胃1次,连续8天,正常组与模型组每鼠每日按20ml/kg体重灌服去离子水;高剂量组每鼠每日按40g/kg体重灌服(相当于成人临床用量的12.78);低剂量组每鼠每日按20g/kg体重灌服(相当于成人临床用量的6.39);对照组每鼠每日按8.56mg/kg体重肌注黄体酮(相当于成人临床用量的12.78)。于妊娠第7天和第8天,除了正常组,其余组均给予4mg/(kg·d)的剂量灌服米非司酮。于第9天腹主动脉采血,提取血清,用酶联免疫法进行指标检测,并记录正常胚胎的数量。

2. 研究目标

探索该方治疗先兆流产的机制,本课题以肾虚流产大鼠为模型,检测该方干预后的免疫因子、凝血功能等指标的表达,为该方的临床运用提供科学依据。本研究能为丁氏妇科经验方的推广应用、中医药新药的研究奠定基础,

本课题在以往临床研究的基础上,用褚氏安胎方配成所需浓度给予早孕大鼠灌胃,通过白介素-2、白介素-4的检测及着床胚胎数量的观察,探索褚氏安胎方调节免疫应答、安胎的作用机理为临床提供客观依据,以便本药更好地推广应用。

3. 拟解决的关键科学问题

观察丁氏妇科补肾养血保胎方对肾虚型先兆流产大鼠免疫因子及凝血功能的影响,探讨其安胎机制。关于止血机制、基因表达等方面的研究。

本课题根据中医基本理论,结合导师学术思想及现代医学理论,并借助现代科学方法,通过动物实验,建立先兆流产大鼠模型,从免疫学角度进一步研究褚氏安胎方治疗先兆流产的机制,揭示中医药治疗本病的作用机理,旨在研究其疗效并为更有效地用于临床治疗提供依据。

(三)拟采取的研究方案及可行性分析。

.研究方法

1.材料及方法

1.1 动物  SPFSD大鼠,其中雌鼠80只,雄鼠40只,3-4月龄,体重200g-300g湖南省长沙市天勤生物有限公司提供,许可证证号:SCXK()2014-0011在贵阳中医学院动物研究所适应性喂养1周。

1.2药物  保胎方:由黄芪、党参、炒白术、菟丝子、川断、桑寄生、阿胶珠、白芍、甘草、仙鹤草等组成。中药由贵阳中医学院第一附属医院提供,水煎、浓缩,置于4℃冰箱冷藏。米非司酮纯粉剂:产品编号:C84-1587-1G,由广州市齐云生物技术有限公司生产(批号:MB1587)。保胎灵:(国药准字Z22026139)生产企业:吉林省辽源亚东有限公司羟基脲:由北京嘉林药业股份有限公司生产(批准文号:国药准字1H3080239)。

1.3仪器与试剂  微型高速离心机:C2500-R-230V美国Labnet ;全自动酶标仪:Multiskan MK3 Thermo scientific;电热恒温培养箱:ICV-450日本ASONE;尼康Eclipse 55i/50i生物显微镜;超低温冰箱。电子天平:FA1004N电子分析天平;电热恒温水浴锅:HH-4数显双列四孔水浴锅,常州华冠仪器制造有限公司。大鼠γ干扰素(IFN-γ)试剂盒、大鼠白介素2IL-2)试剂盒、大鼠白介素4IL-4)试剂盒、大鼠白介素10IL-10)试剂盒、凝血酶原时间试剂盒、纤维蛋白原试剂盒等试剂均来源于武汉伊莱生物科技有限公司。 

1.4方法及步骤

1.4.1妊娠动物模型制备

造模方法参照《药理实验方法学》[2]:连续采用阴道分泌物涂片观察所有雌鼠动情周期2周,去除无动情周期及无稳定动情周期大鼠3只,入组有规律动情周期雌鼠77只与雄鼠按2:1合笼过夜,次晨查看雌鼠阴道栓,发现阴道栓为妊娠第1,无阴道栓者取雌鼠阴道分泌物镜检,如发现精子即为妊娠第1天。

1.4.2分组与肾虚先兆流产动物模型建立

参照《人类疾病动物模型》[3]:将交配成功的72只雌鼠随机编号分为6个组,分别为保胎方高剂量组、保胎方中剂量组、保胎方低剂量组、保胎灵对照组、模型对照组、空白对照组,每组12只,各组之间体质量比较,差异无统计学意义。自妊娠第3天开始至第12天,除外空白组,其余各组每天下午灌胃羟基脲(450mg/kg2ml[4],并在造模第10天羟基脲灌胃6小时后,分别加灌米非司酮溶液(RU486) 3.75mg/kg溶液2ml[3],旨在诱导流产发生,模型建立完成。

1.4.3药物干预

在妊娠第3-12天,保胎方高、中、低剂量组:根据动物体质量换算,早晨分别予保胎方水煎液43.12g/kg/d21.56g/kg/d10.78g/kg/d灌胃各2ml;保胎灵组:早晨保胎灵0.7g/kg/d灌胃,2m1/日;模型对照组:早晨生理盐水灌胃2ml/d;空白对照组:早晨及下午均生理盐水灌胃2ml1次,均持续10日。

1.5 标本采集及处理

    各组大鼠妊娠第1d、第10d称体质量。妊娠第13d(用米非司酮24小时后)以5%戊巴比妥麻醉后,摘眼球采血,3000r·min-1离心,取上层血清待测。取血后处死大鼠,摘取子宫及卵巢,剥去其脂肪,称质量;解剖子宫,观察子宫变化,统计正常胚胎数及流产胚胎数。

1.6观测指标

1.6.1一般情况  观察大鼠每天在形态、活动、毛色、进食量、大便等。

1.6.2指标检测  采用酶联免疫法(ELISA)检测:血清Thl型细胞因子IFN-γIL-2Th2型细胞因子IL-4IL-10含量、PTFbg含量。

1.6.3解剖学观察及保胎率计算 取血后,取出孕鼠子宫卵巢,称重,观察外观,剖开子宫,计数各组每只大鼠胚胎个数,通过胚胎个数之和比较推算各组疗效,算出保胎率,保胎率为正常胚胎数/(正常胚胎数+流产胚胎数)。正常胚胎数、流产胚胎数的判定标准参照《人类疾病动物模型》[3]:正常胚胎:子宫粗大呈串珠状、粉红色,解剖后宫内未见瘀血,胚胎完好,呈粉红色;部分流产子宫:宫腔内见瘀血,胚胎不完整,或只有胎盘母体部及胎盘胎儿部存在;完全流产子宫:母鼠体重下降明显,子宫呈竹节样改变,宫腔内明显瘀血或坏死组织,或仅见到胚胎着床点,或胚胎黑褐色,或曾出现阴道出血[5]

1.7统计学处理  应用SPSS 16.0统计软件进行分析和处理。

1.7.1 计量资料:数据方差齐性,呈正态分布,采用方差分析,组间比较使用LSD检验,方差不齐时采用Tamhane’sT2检验;不符合正态分布的两独立样本比较,采用Wilcoxon秩和检验。 

1实验材料

1.1实验动物

选用SPFSD大鼠,未孕雌性大鼠80只,鼠龄10周,体重为197.5±16.3g,雄性大鼠40只,体重为218.9±20.8g,由郑州大学实验动物中心提供。许可证号:SCXX(豫)2010-0002

1.2饲料

一级大鼠标准全营养饲料,由郑州大学实验动物中心提供,规格:40kg/袋。合格证:河南省实验动物委员会医动字第0002331

1.3实验用药

(1)褚氏安胎方(以下简称CSATF)药物组成:川断、杜仲、菟丝子、太子参、黄芩、白术、阿胶、旱莲草、苏梗、砂仁、炙甘草,每付中药重188克,将上药煎成分别含生药量为2g/ml的浸膏(由河南省中医院制剂中心提供),放冰箱4℃保存。

(2)米非司酮片25mg/片,北京紫竹药业有限公司国药准字号:批号

(3)黄体酮注射液1ml:20mg浙江仙琚制药股份有限公司国药准字号:批号:120401

(4)生理盐水250ml/瓶,山东华鲁制药有限公司生产。

(5)水合氯醛,上海化学试剂制药厂,批号:

1.4实验器材

载玻片,灌胃器,1ml10ml注射器,移液器,试管架、试管、离心管、手术剪、镊子、组织剪、止血钳、直镊、眼科剪、大鼠固定板、无菌棉签,一次性橡胶手套、口罩、帽子等。

1.5主要试剂及仪器

大鼠白介素2ELISA试剂盒:由上海研生生化试剂有限公司提供,批号为:GS-E10002大鼠白介素4ELISA试剂盒:由上海研生生化试剂有限公司提供,批号为:GS-E10142光学显微镜:OLYMPUSBH227561-6-材料与方法电子天平:博达ACS-3BC精密天平:BS223德国220g/1mg离心沉淀机:LXJ-64-01冰箱:海尔

2实验方法

2.1实验条件、分组实验室环境符合普通级动物实验室要求,室温20℃左右,湿度65±5%;通风、清洁,饲料、供水充足,安静。所有大鼠适应性饲养1周,动物分笼饲养,每日定时大鼠体重变化情况。对雌鼠每日清晨8:00做阴道涂片检查,光镜下见大量阴道脱落细胞,并至少观察两个稳定动情周期的为合格动情雌鼠。将选取合格的雌鼠与雄鼠以2:1雌雄合笼,次晨阴道涂片镜检有大量精子者或有阴道栓者为妊娠第1d。最终选定60只符合要求的孕鼠,随机将60只孕鼠随机分为5组,正常组12只,模型组12只,CSATF高剂量组12只,CSATF低剂量组12只,黄体酮组12只。

2.2给药方法妊娠第1天至第8天开始各组大鼠给药方法如下:(1)正常组:每鼠每日按20ml/kg体重灌服去离子水。

2)模型组:每鼠每日按20ml/kg体重灌服去离子水。(3CSATF高剂量组:每鼠每日按40g/kg体重灌服(相当于成人临床用量的12.78)。(4CSATF低剂量组:每鼠每日按20g/kg体重灌服(相当于成人临床用量的6.39)。(5)黄体酮组:每鼠每日按8.56mg/kg体重肌注黄体酮(相当于成人临床用量的12.78)。因操作失误,模型组与高剂量组于第2天各死亡1只。

2.3先兆流产模型的建立于妊娠第7天和第8天分别按4mg/(kg·d)的剂量灌服米非司酮,诱发先兆流产,第9天进行观察。若大鼠阴道大量或者少量出血,解剖后子宫呈“竹节状”,肿大,宫腔内胚胎呈黑褐色,或子宫暗紫,虽未瘀血但无胚胎,即视为成功先兆流产模型。

2.4指标的观察与检测(1)孕鼠一般情况观察:精神状态、毛色、进食等情况。

2)于妊娠第9天上午9点以10%水合氯醛经腹腔麻醉,剂量0.3ml/100g。麻醉满意后,在无菌条件下从腹主动脉取血5-8ml4℃,2000/分钟速度下离心15分钟),用移液器吸取血清,分装置于-20℃冰箱中备用。采用采用酶联免疫分析法测定,具体-7-褚氏安胎方对先兆流产大鼠模型细胞因子影响的实验研究操作方法严格按照试剂盒说明书执行。无菌条件下摘取大鼠子宫,称重并记录其着床胚胎数。

2.5统计学处理

所有数据均采用Spssforwindows(ver18.0)软件进行统计处理,多组间比较用单因素方差分析,计量资料结果以均数(x)±标准差(s)表示。P<0.05为差异有显著性意义,P<0.01为差异极显著。

.关键技术说明:

4.1动物模型的研究

目前,米非司酮、米索前列醇、溴隐亭、催产素等常用于复制先兆流产模型。米非司酮是一种孕激素受体(PR)拮抗剂,其与PR的亲和力是孕酮的5倍,进入体内后能有效地竞争PR,影响孕酮在其靶器官的生理功能表现,抑制脾细胞分泌合成孕酮诱导阻断因子(PIBF),阻断孕激素在靶器官发挥生理效应,进而具有抗着[21]床、终止早孕的效果。米索前列醇可促进子宫平滑肌收缩,软化宫颈,使坏死[22]胚胎及胎盘组织排出宫腔外,但与胚胎的死亡无直接关系。时彦等研究γ干扰素(IFN-γ)IL-4等细胞因子在流产过程中发挥的作用及其机制,于孕6-8d每天腹腔注射溴隐亭0.3mg/kg,连续3d,成功复制溴隐亭致先兆流产大鼠模型,由于此方法采用腹腔注射,容易对大鼠血管、胚胎等造成直接的损伤或死亡,对[23]结果形成干扰,故本实验未采用此方法。朱斌娥在制备大鼠先兆流产模型,于大鼠妊娠第1天用骨折器造成双后肢股骨上端封闭性骨折,而后每天扭断骨折处,加重损伤,持续至妊娠第11天,由于此种方法不易操作,每只动物对疼痛不易量[24]化,故本实验未采用次方法。宁艳等采用羟基脲和米非司酮建立肾虚黄体抑制大鼠流产模型:从妊娠第1天始至第l天灌服羟基脲蒸馏水溶液,于妊娠第10天灌服米非司酮(3.75mg/kg)1次,制备肾虚流产模型,此种方法是种复合模型,与[25]本实验的目的不一致,故未采用。张晋峰等采用针刺和催产素制小鼠流产模型,方法:雌、雄小鼠以21合笼交配,于小鼠妊娠第9日将各组孕鼠头下垂倒置,用电针刺激两侧三阴交加合谷穴,使小鼠发生不自主的跳动到惊厥,持续30分钟,次日肌肉注射催产素2u/kg,诱发流产,此种方法流产成功率高,但是大鼠穴位不宜选择,电针操作过程复杂,大鼠不宜配合,故本实验未选用此方法。张艳等-20-理论探讨[26]于大鼠妊娠第7天开始分别按4mg/(kg·d)的剂量灌服米非司酮,连续2天,第9天进行观察,成功复制大鼠先兆流产模型。由于张艳的造模方面简便可行,易于操作,模型成功率高,适用于动物血清白介素水平等的研究,故本实验使用该造模方法进行复制先兆流产大鼠模型。

4.2造模药物的选择

本动物实验成功的关键是各种实验条件的具备,以及造模的药物的选择,而实验中所选药物米非司酮是经过医学界学者不断实践基础上的成果,因此经过多方面研究选定米非司酮作为先兆流产模型制作的药物。研究表明米非司酮(RU486)能使Th2型细胞因子的分泌量减少,增加Thl型细[27]胞因子的分泌,启动流产。RU486PR的亲和力是孕酮的5倍,是一种孕激素受体(PR)拮抗剂,能够有效地竞争PR,影响孕酮在其靶器官的生理功能表现,促进脾细胞的合成分泌孕酮诱导阻断因子阻断孕激素在靶器官的生理效应,具有流产作用。RU486可通过影响母体生殖轴的各器官,诱导中期黄体溶解,使输卵管的运动节律、形态失常,致受精卵不能适时到达宫腔,且能使子宫内膜由增生期向分泌期转变,使之与胚泡的发育不同步,影响子宫内膜对受精卵的容受性从而干扰受精卵的着床,终止早期妊娠。4.3CSATF对孕鼠外周血中IL-2IL-4的作用Thl细胞主要介导细胞免疫及局部炎症反应,能促进巨噬细胞活化,介导强[28]烈的迟发型超敏反应,具有胚胎毒作用。IL-2Th1细胞生长的必需因子和自分泌因子,在静止状态下,IL-2的产生主要由接触有丝分裂原或抗原后所促发,同时在其他刺激因素下达到最大效应。这种反应能够激活静止的T细胞包括DNA合成及细胞分裂。IL-2不但调节了T细胞的活性,并与其他因子一起,与有丝分裂原、抗原及抗免疫球蛋白抗体结合,影响B细胞增生及可产生抗体的浆细胞。IL-2主要分布于细胞滋养细胞、早孕绒毛合体滋养细胞和早孕蜕膜细胞胞浆中,在早期妊娠母胎界面中发挥着重要的作用,是确保正常免疫功能的必要因子,主要介导细胞免疫,有免疫杀伤作用,但过多的表达,其免疫杀伤作用将促进巨噬细胞活化、细胞毒作用,能够诱导吞噬细胞进入胎盘部位,从而损伤胎盘滋养层细胞,对滋养层的生长起到抑制作用,阻滞了胚胎的发育及胎盘功能而导致流产。Th2细胞主要是介导体液免疫反应,促进肥大和嗜酸细胞分化,促进抗体形成,从而抑制免疫炎症,减少因此引起的过度损伤。Th2细胞因子中的IL-4有保护胎盘的作用,它可抑制淋巴因子激活杀伤细胞发生,减少鼠T细胞上IL-2受体表达及人T细胞上IL-2生成,调节单核细胞功能,减少IL-1及肿瘤坏死因子生成的作用;IL-4在子宫胎盘中还可抑制NK细胞黏附于血管内皮细胞及其进一步的聚集和活化,并抑制由IL-2诱导的IL-2NK细胞激活对滋养层细胞的损伤,抑制-21-褚氏安胎方对先兆流产大鼠模型细胞因子影响的实验研究免疫炎症,具有免疫营养作用,诱导Th0细胞向Th2细胞分化,从而有利于早期妊娠胎盘细胞的生长分化。因此,如何提高Th2细胞因子的水平,下调Th1细胞因子的水平,达到呈Th2反应型的动态平衡是治疗先兆流产的关键。由实验可知,正常组、高剂量组、低剂量组与黄体酮组先兆流产大鼠血清IL-4水平均高于模型组,差异显著,具有统计学意义(P<0.01,高剂量组大鼠IL-4水平与黄体酮组比较,虽无统计学意义,但平均水平有升高趋势,故CSATF有升高孕鼠血清IL-4水平的作用,功效可能与黄体酮相当,表明CSATF能够促进胎盘细胞的生长分化;高剂量组、低剂量组与黄体酮组IL-2水平均低于模型组,差异显著,具有统计学意义(P<0.05),表明CSATF有降低孕鼠血清IL-2水平的作用,能够抑制滋养层细胞的损伤,对胎盘功能起到保护作用;由于中药高剂量组与低剂量均有升高IL-4水平,降低IL-2水平的作用,与模型组比较,差异显著,有统计学意义(P<0.01P<0.05);根据各组胚胎数量的统计,正常组、高剂量组、低剂量组与黄体酮组胚胎数量明显多于模型组,差别具有统计学意义(P<0.01),可知CSATF可使先兆流产大鼠Th1/Th2细胞因子平衡向Th2的方向偏移,从而有利于妊娠的继续,降低了流产率。综上可知,CSATF可明显提高流产大鼠模型血清中IL-4水平,降低IL-2的水平,使Th1/Th2细胞因子平衡向Th2的方向偏移,保持Th1/Th2细胞因子动态平衡,使先兆流产动物胚胎数增加,增强其对外界的抗干扰能力,从而保护胚胎免受内外环境的损害,提高先兆流产保胎成功率。

组方与方义

分析:方中川断味苦,辛,性微温,具有补肝肾,强筋骨,调血脉,续折伤,止崩漏的功用;杜仲味甘微辛,性温,具有补肝肾,强筋骨,安胎之功效;菟丝子味甘,性温,滋补肝肾,固精缩尿,安胎,明目,止泻;三药共奏补肝肾益精、养血安胎、固摄冲任之效,肾旺自能荫胎,导师认为菟丝子非但能直接补肾,又能滋肝阴而补肾,补而不燥,因肝肾同源,母体阴虚必伤及肝血,而进一步导致肾虚,胎元不固,正如《傅青主女科》曰:“夫养胎半系于肾水,然非肝相助,则肾水实有独立难支之势,故保胎必滋肾水,而肝血断不可不顾。”所以善补肾者必先养肝,故重用为君;太子参味甘,微苦,性平,补益脾肺,益气生津;白术味甘、苦,性温,具有健脾益气,燥湿利尿,止汗,安胎的功效,两药共同补脾气,健胃,安胎,是以后天养先天,生化气血,先后天同补,加强安胎之功,补气安胎前人多用党参,但是党参偏温燥,补气之中易助热伤津,而用太子参补气、养阴、生津,补气而不伤津,更显其妙,黄芩味苦,性寒,具有清热燥湿,泻火解毒,止血,安胎之功效,阿胶味甘、平,具有补血,滋阴,止血,润肺的功能,旱莲草味甘、酸,性凉,具有凉血、止血、滋补肝肾、清热解毒之效,五药相协,具有健脾益气,养阴清热,止血安胎,共为臣药;苏梗味辛,性温,具有理气宽中,止痛,安胎之功,砂仁味辛,性温,具有化湿开胃,温脾止泻,理气安胎之功,两药合用,理气和胃安胎,以防诸药滋腻,为佐药;炙甘草调和诸药为使。全方共奏补肾培脾,养阴清热安胎之效。

3.4单味药研究:川断:味苦、辛,性微温。归肝、肾经。具有补肝肾,强筋骨,调血脉,续折伤,止崩漏的作用。用于腰背酸痛;肢节痿痹;跌扑创伤、损筋折骨、胎动漏红、血崩、遗精、带下、痈疽疮肿。酒续断多用于风湿痹痛,跌扑损伤。盐续断多用于腰膝酸软。《名医别录》指出:“妇人崩中漏血,金疮血内漏,止痛生肌肉,及腕伤恶血腰痛,关节缓急。”《本草经疏》云:“川断为治胎产、续绝伤、补不足、疗金疮、理腰肾之要药也。”现代药理研究作用有:1.抗维生素E缺乏症;2.止血、镇痛作用:对痈疡有排脓、止血、镇痛、促进组织再生的作用。中医理论结合现代医学研究都显示了川断的良好的保胎作用。杜仲:味甘、微辛,性温。归肝、肾经,具有补肝肾,强筋骨,安胎之功效。治腰脊酸疼,足膝痿弱,小便余沥,阴下湿痒,胎漏欲堕,胎动不安,高血压。《神农本草经》曰:“主腰脊痛,补中益精气,坚筋骨,强志,除阴下痒湿,小便余沥。”《药性论》云:“治肾冷臀腰痛,腰病人虚而身强直,风也。腰不利加而用之。”《本草正》曰:“暖子宫,安胎气。”《中华人民共和国药典》:“补肝肾,强筋骨,安胎。用于肝肾不足,腰膝酸痛,筋骨无力,头晕目眩,妊娠漏血,胎动不安。”杜仲是名贵滋补药材,其有效成分中除了含有大量已知活性的药用成分外,还含有多种营养物质,营养物质是杜仲保健作用的重要物质基础。杜仲具有补肝肾,强筋骨,清除体内垃圾,加强人体细胞物质代谢,防止肌肉骨骼老化,平衡人体血压,分解体内胆固醇,降低体内脂肪,恢复血管弹性,利尿清热,广谱抗菌,兴奋中枢神经,提高白血球数量,增强人体免疫力等显著功效。菟丝子:味甘,性温。归肝、肾、脾经。具有补肾益精,养肝明目,安胎,止泻之效。用于肾虚腰痛,阳痿遗精,尿频,宫冷不孕,肝肾不足之目暗不明,脾肾阳虚之便溏泄泻,以及肾虚胎动不安之之功效;外治白癜风。菟丝子善补而-18-理论探讨不竣,是平补肾阴阳之品。罗元恺教授亦认为菟丝子为补肾安胎的首选药物,此药既补阳,又能补阴,不辛燥,不滋腻。《神农本草经》曰:“主续绝伤,补不足,益气力肥健”,“久服明目,轻身延年”。《山东中药》:“治妇人常习流产。”《本草经疏》曰:“菟丝子补脾肾、肝经之要药”。现代研究表明,菟丝子含有多种维生素,可以补充胎儿及母体之不足。太子参:味甘、微苦,性平。归脾、肺经。具有补益脾肺,益气生津之功用。治肺虚咳嗽,脾虚食少,心悸,怔忡,水肿,消渴,精神疲乏。太子参味甘、微苦而性平,偏微寒,既能益气,又可养阴生津,且药力平和,为一味清补之品,适用于脾肺亏虚、气阴不足、气津不足诸症。《陕西中草药》:“补气益血,健脾生津。治病后体虚,肺虚咳嗽,脾虚腹泻,小儿虚汗,心悸,口干,不思饮食。”黄芩:味苦,性寒。归肺、胆、脾、胃、大肠、小肠经。具有清热燥湿,泻火解毒,止血,安胎,降血压之功效。用于湿温、暑温胸闷呕恶,湿热痞满,泻痢,黄疸,肺热咳嗽,高热烦渴,血热吐衄,痈肿疮毒,胎动不安。抗病原体、抗炎、调节免疫功能、解热、镇静、保肝、利胆等。《本草图经》:“及主妊娠安胎散,亦多用黄芩”朱震亨曰:“黄芩、白术乃安胎圣药,俗以黄卒为寒而不敢用,盖不知胎孕宜清热凉血,血不妄行,乃能养胎,黄芩乃上、中二焦药,能降火下行,白术能补脾也。”《本草纲目》也有云:“黄芩得白术安胎。”白术:味苦、甘,性温。归脾、胃经。具有健脾益气,健胃,燥湿利尿,化痰,止汗,安胎之功效。

.技术路线(见下图)

4.可行性分析

(四)本课题的特色与创新之处

根据先兆流产病人的生理特点,导师确立了中医治疗先兆流产的大法,即“补肾培脾,养阴清热安胎”,与此同时也注重病人日常生活的起居饮食与心理辅导,在诊治疾病的同时积极与患者交流。导师治疗本病辨病与辩证相结合,根据四诊情况强调辨证论治安胎,并结合《妇人规》所载“腹痛、下血、腰酸、下坠”胎动不安的轻重变化症状,来判定胚胎的发育情况,以确定积极安胎,或者胎儿预后不良绝不姑息安胎,告知病情,让病人做下胎准备,以免贻误病情。正如《妇人大全良方》所载:“妊娠羸瘦,或挟疾病,脏腑虚损,气血枯竭,既不能养胎,致伤胎气不固,终不能安者,可下之,免害妊妇。”可知导师师古而不拘泥于古,在不断学习实践中与时俱进。导师认为妊娠初始之脉当滑数有力,按之应手,一派气血冲和之象,如此孕妇先天肾气充实,后天脾胃健旺,面色红润,目光有神,声音洪亮,舌红,胎薄白,是以气血充养,胎元固,虽有简单劳作,未能见有胎堕者。然体弱多病者,或者常滑胎不孕者,其脉多沉弱无力,或久按无力,肾脉按之多细弱短小,病人多陈述腰酸乏力、纳眠差或有阴道下血,从外可见病人面色黯淡无光泽,语声低微,目光少神,少动,舌黯淡,舌体或者胖大或者瘦小,胎黄厚或黄燥;其肾气必弱,无阳则阴无以生,肾阴随之亏损,阴虚则内热从中生,部分孕妇会减衣多饮水,仍觉燥渴难忍,根据五行相生的规律,水能生木,肾中阴水即耗,木难以生,肝血不足,虚阳易动,肝阳上亢者,轻者扰乱情志,重者发为子痫;先天不足须后天充养,奈何脾胃已虚,即使每日佳肴美味,或不欲食,纵使入于体内,胃弱不能腐熟,脾虚不能运化水谷,气血无以生,津液无以化,反阻碍气之通降,血之运行,久之胃气不得已降,腑气不得已通,气血必瘀滞,水饮停于内,然胎儿自不能生化气血供己发育,全赖母体气血供养,此时母体不能自养,何有余气血供给胎儿,胎儿得不到供养,引起“腹痛、下血、腰酸、下坠”等症状,若不能母病不愈,胎最终不保。再结合导师自拟褚氏安胎方,无不体现辨证之精髓,用药之巧妙。随着生活水平的提高,人们越来越关注自身的健康,若妇女获珍贵儿,或者心情不舒,加之出现流产之先兆,必生疑虑,担惊受怕,多不利于疾病的治疗,导师察病亦察心,深知情绪会导致疾病进一步加重,每每遣方用药的同时,给予心理疏导,引导其生活起居,避外邪,顺气候,正所谓天人相应,体现了中医的整体观。结合现代医学研究,胎儿作为母体一异物,部分母体会有一定排异反应而引起流产的发生,师多建议病人保胎至少三个月,未见不适症状出现,方可停药观察,跟师坐诊随访可知,保胎足三个月极少有不明原因流产者,从临床实践中认证了导师的理论符合实际,证实了导师理论的精准,褚氏安胎方的良好效果。

(五)年度研究计划及预期研究结果

1.年度研究计划

2. 预期研究结果

2.结果

2.1 保胎方对各组大鼠一般情况的影响

空白对照组大鼠一般状态良好,反应灵活,毛色光滑,饮水进食增加,大便正常。模型对照组从第2天开始出现拱背、蜷缩,且逐渐出现进食量减少、大便稍稀、被毛疏松。保胎方高、中剂量组及保胎灵组大鼠均有轻微少动、拱背、被毛疏松现象。保胎方低剂量组少数大鼠出现蜷缩少动、拱背、被毛疏松表现,出现时间较模型组晚,饮水量与进食量无明显增加。

2.2  保胎方对大鼠体重及子宫卵巢重量的影响

    体重变化及子宫卵巢重量:与空白组比较,模型组均降低,差异有统计学意义P0.05。与模型组比较,高中剂量组、保胎灵组的体重及子宫卵巢重量均有增加P0.05),低剂量组体重变化及子宫卵巢重量均有增加,差异无统计学意义P0.05;与保胎灵比较,高中剂量组体重变化及子宫卵巢重量差异无统计学意义P0.05)。

2.3 保胎方对大鼠胚胎数及活胎率的影响  

空白组孕鼠子宫结节状膨大,呈光洁粉红色,胚胎大小均匀,发育良好,胚胎间界限清晰,组织完好;其余5组孕鼠子宫均可见瘀血,模型组胚胎有明显瘀血痕迹和不全胚胎。  

正常胚胎数:模型组与空白组比较,差异有统计学意义P0.05保胎方各剂量组、保胎灵组胚胎数较模型组增加(P0.05);与保胎灵组比较,低、中剂量组的差异有统计学意义(P0.05,高剂量组差异无统计学意义P0.05)。

活胎率:模型组与空白组比较,差异有统计学意义P0.05保胎方高中剂量组、保胎灵组活胎率较模型组高(P0.05),保胎方低剂量组与模型组差异无统计学意义(P0.05);与保胎灵组比较,低剂量组与其差异有统计学意义(P0.05,高中剂量组与其差异无统计学意义P0.05)。(见表2

2.4 保胎方对大鼠血清Th2型细胞因子(IL-4IL-10/Thl型细胞因子(IFN- γIL-2)的影响

从表3可知,与空白组比较,模型组的IL-2IFNIL-4IL-10的浓度变化差异有统计学意义(P0.05)。与模型组比较,高中低剂量组、保胎灵组的IFN- γIL-2的浓度较模型组下降,差异有统计学意义P0.05高中低剂量组、保胎灵组的IL-10浓度较模型组增加(P0.05);与模型组比较,IL-4浓度,保胎中剂量组升高,差异有统计学意义P0.1),保胎低、高剂量组较模型组增加,但差异无统计学(P0.05)。

由表4可知,与空白组比较,模型组的IL4/IL2IL4/IFN-γIL10/IL2IL10/IFN-γ差异有统计学意义(P0.05,或P0.1)。与模型组比较,保胎方各剂量组及保胎灵组,IL4/IFN-γIL10/IFN-γ差异有统计学意义;中、低剂量组IL4/IL2较模型组高,差异有统计学意义(P0.05保胎高剂量组较模型组增加,但差异无统计学(P0.05)。与模型组比较,高、中、低剂量组及保胎灵组IL10/IL2与其差异有统计学意义(P0.1)。

2.5 保胎方对先兆流产大鼠凝血指标的影响

    与空白组比较,模型组的PTFbg浓度差异有统计学意义P0.05)。与模型组比较,保胎方各剂量组PT时间较长(P0.05),保胎方低、中组和保胎灵组Fbg的浓度均较小(P0.05)。与高剂量组相比,中剂量组的PTFbg浓度差异有统计学意义(P0.05)。(见表5

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