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长链非编码RNAGLS-AS 介导的c-Myc/GLS 通路在胰腺癌中的作用及机制
添加时间: 2021/7/25 13:27:54 来源: 作者: 点击数:

中文摘要

胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度极高的肿瘤,由于其组织具有高度纤维化及缺乏血管的特征,以及癌细胞内发生的一系列代谢重编程改变,使得胰腺癌至今几乎尚无有效的治疗方法。我们在研究过程中发现谷氨酰胺酶(GLS)的反义长链非编码RNAlncRNAGLS-AS)在胰腺癌中发挥着调控肿瘤发生发展的作用。同时,我们发现lncRNAGLS-AS在胰腺癌中的表达与肿瘤营养应激微环境相关。因此,本研究旨在将胰腺癌营养应激微环境与lncRNAGLS-AS联系起来,逐步揭示lncRNAGLS-AS调控GLS表达的机制,及其如何通过c-Myc/GLS通路在营养应激微环境中介导胰腺癌细胞代谢重编程,以此为胰腺癌的治疗提供新的思路以及理论基础。

通过高通量测序分析筛选出胰腺癌组织(PC)与癌旁正常组织(NP)差异表达的lncRNAGLS-ASAK123493.1)作为研究对象。NorthernBlot实验检测lncRNAGLS-AS在胰腺癌组织、细胞中的表达;通过RNA荧光原位杂交技术(RNA-FISH)明确lncRNAGLS-AS在胰腺癌细胞系BxPC-3PANC-1中的亚细胞定位。收集武汉协和医院胰腺癌患者手术标本,包括PC和与之对应的NP组织30对;使用荧光定量PCR技术检测lncRNAGLS-ASGLSmRNA的表达。在胰腺癌细胞系BxPC-3PANC-1细胞中转染lncRNAGLS-AS的小干扰RNA或过表达质粒。通过MTT实验、平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖活性;划痕实验、Transwell实验分别检测细胞的迁移,侵袭能力。再使用慢病毒包被lncRNAGLS-AS的小干扰RNA,包被的慢病毒在转染PANC-1细胞后用于构建裸鼠异种移植瘤模型,以观察转染后细胞在体内生长、转移能力的改变。用荧光定量PCR技术检测胰腺癌细胞系在转染lncRNAGLS-AS的小干扰RNA或者过表达质粒后,以及30对胰腺癌组织中lncRNAGLS-ASGLSmRNA表达;同时用蛋白免疫印迹(WesternBlot)检测GLS蛋白水平。使用RNA原位杂交(RNA-FISH)与GLS蛋白免疫荧光共染,观察lncRNAGLS-ASGLS蛋白在胰腺癌组织与胰腺癌细胞系中共定位的情况。针对lncRNAGLS-ASGLS前体RNAGLSpre-mRNA)分别设计RNA探针,使用RNA荧光原位杂交技术对lncRNAGLS-ASGLSmRNA在胰腺癌细胞中的共定位进行检测。通过体外转录技术人工合成lncRNAGLS-AS的不同部位片段,并用生物素标记,进一步用RNApulldown技术探究lncRNAGLS-ASGLS前体RNAGLSpre-mRNA)的结合位置。α-鹅膏蕈碱阻断胰腺癌细胞系RNA合成后,观察转染lncRNAGLS-AS小干扰RNA或者过表达质粒对GLSpre-mRNA稳定性的影响。利用蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)证明ADAR1Dicer在胰腺癌细胞中结合。RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)证明ADAR1/Dicer蛋白复合体与GLS-AS/GLSpre-mRNA双链RNAdsRNA)复合体结合。在胰腺癌细胞系中分别使用小干扰RNA敲低ADAR1Dicer表达后,荧光定量PCR检测lncRNAGLS-ASGLSpre-mRNA表达水平,以及α-鹅膏蕈碱处理上述转染细胞后GLSpre-mRNA的稳定性;WesternBlot检测转染细胞中ADAR1DicerGLS蛋白水平。体外模拟胰腺癌组织微环境,包括低氧、酸性、低糖以及低谷氨酰胺,荧光定量PCR检测lncRNAGLS-AS的表达,探究lncRNAGLS-AS在胰腺癌中低表达的驱动因素。RNA荧光原位杂交检测低糖、低谷氨酰胺环境下lncRNAGLS-AS的表达水平。荧光定量PCRWesternBlot检测低糖、低谷氨酰胺环境中GLSmRNA及蛋白的表达。WesternBlot检测低糖、低谷氨酰胺环境中c-Myc蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀(ChIP)验证c-Myc蛋白与lncRNAGLS-AS上游启动子结合序列。双荧光素酶报告基因检测c-Myc蛋白对lncRNAGLS-AS启动子转录活性的影响。LncRNAGLS-AS的慢病毒载体转染BxPC-3细胞系,以慢病毒空载体作为阴性对照(LV-Vector),构建裸鼠异种移植瘤模型,观察lncRNAGLS-AS过表达在体内对肿瘤生长、转移的影响。

英文摘要

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly malignant tumor. Due to the the pathological features of high fibrosis and vascular deficiency of pancreatic cancer, as well the metabolic reprogramming in cancer cells, there is almost no effective treatment for pancreatic cancer. The aim of this study is to investigate how our newly discovered antisense long non-coding RNA (lncRNA GLS-AS) of glutaminase (GLS) can reprogram metabolism by regulating c-Myc/GLS signaling pathway under nutrition stress microenvironment in pancreatic cancer. Our study investigated the effect of dysregulated lncRNA GLS-AS on changing tumor growth and metastasis, and revealed its novel regulatory mechanisms, which may provide new insights and theoretical bases for the treatment of pancreatic cancer.

 Differentially expressed of long non-coding RNAs (lncRNAs) in pancreatic cancer tissues were screened by next-generation sequencing. The antisense long non-coding RNA GLS-AS (AK123493.1) of glutaminase (GLS) was selected as a target of continued study. The expression of lncRNA GLS-AS and GLS mRNA was detected by real-time quantitative PCR. Northern blot analysis confirmed that lncRNA GLS-AS was expressed in pancreatic cancer tissues and cells. RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) emerged the subcellular localization of lncRNA GLS-AS in pancreatic cancer cells. Surgical specimens of pancreatic cancer patients were obtained from Wuhan Union Hospital, including 30 pairs of cancer tissues and corresponding normal tissues adjacent to each other. Small interfering RNAssiRNASsor over expression plasmid of lncRNA GLS-AS was transfected into pancreatic cancer cell lines BxPC-3 and PANC-1 cells. The proliferation activity of the transfected cells was detected by MTT assay and colony formation assay; the wound healing assay and Transwell assay were used to detect cell migration and invasion ability. Lentiviral was used to coate lncRNA GLS-AS small interfering RNA. The coated lentivirus was transfected into PANC-1 cells and used to xenograft model in nude mice to observe the growth and metastasis ability of the transfected cells in vivo. qPCR and Western Blot were used to detect the expression of lncRNA GLS-AS /GLS mRNA and GLS protein in pancreatic cancer tissues and in pancreatic cancer cells which transfected with small interfering RNA or overexpression plasmid of lncRNA GLS-AS. Simultaneously, co-staining of RNA in situ hybridization and GLS protein immunofluorescence to observe the co-localization of lncRNA GLS-AS RNA and GLS protein in pancreatic cancer tissues and pancreatic cancer cell lines. Specific RNA probes were designed for lncRNA GLS-AS and GLS precursor mRNA (GLS pre-mRNA). LncRNA GLS-AS and GLS mRNA were co-localized in pancreatic cancer cells using RNA fluorescence in situ hybridization. Fragments of different parts of lncRNA GLS-AS were synthesized by in vitro transcription technique and labeled with biotin, the biotin-labeled probes were used in RNA pulldown assay to investigate the position of lncRNA GLS-AS binding to GLS pre-mRNA. After α-amanitin blocked RNA synthesis in pancreatic cancer cell lines, the effect of transfection of lncRNA GLS-AS small interfering RNA or overexpression plasmid on the stability of GLS pre-mRNA was observed. Co-immunoprecipitation (Co-IP) was used to demonstrate that ADAR1 binds to Dicer in pancreatic cancer cells. RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) demonstrates that the ADAR1/Dicer protein complex binds to the lncRNA GLS-AS /GLS pre-mRNA double-stranded RNA (dsRNA) complex. In the pancreatic cancer cells, the expression of lncRNA GLS-AS, GLS pre-mRNA and the stability of GLS pre-mRNA after transfected with siRNAs of ADAR1or Dicer and then with treatment of α-amanitin were detected by qPCR, respectively. In vitro simulation of pancreatic cancer tissue microenvironment, including hypoxia, acidity, low glucose and low glutamine, then the lncRNA GLS-AS level was measured by qPCR, to explore why lncRNA GLS-AS low expression in pancreatic cancer. RNA fluorescence in situ hybridization was used to verify the low expression of lncRNA GLS-AS in nutrition stress environments. qPCR and Western Blot were used to detect the expression of GLS mRNA and protein in low levels of glucose and glutamine environments. Western Blot was used to detect the expression of c-Myc protein in low levels of glucose or glutamine deprivation environments. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) verified the binding sequences between c-Myc protein on lncRNA GLS-AS promoter. The dual luciferase reporter assay detected the effect of c-Myc protein on the transcriptional activity of the lncRNA GLS-AS promoter. The lentiviral vector of LncRNA GLS-ASLV-GLS-ASwas transfected into cells, and the lentivirus with empty vector was used as a negative control (LV-NC) to construct xenograft model. The effect of lncRNA GLS-AS overexpression on tumor growth and metastasis was observed.

报告正文

参照以下提纲撰写,要求内容翔实、清晰,层次分明,标题突出请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。

(一)立项依据与研究内容4000-8000字): 

1项目的立项依据(研究意义、国内外研究现状及发展动态分析,需结合科学研究发展趋势来论述科学意义;或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录);

研究意义

研究表明,癌细胞表现出与正常细胞不同的代谢特点。其中最为人熟知的是“瓦伯格效应(Warburg效应)”,即使在氧气存在的情况下,癌细胞倾向于通过“有氧糖酵解”途径利用葡萄糖[1]。因此通过有氧糖酵解产生的丙酮酸转化为乳酸,但不转化为乙酰-辅酶A。为了弥补柠檬酸循环不足,癌细胞通常会激活谷氨酰胺代谢[2]。因此,由于血管供应营养物质和代谢需求旺盛之间存在不足,肿瘤细胞中明显加剧的葡萄糖和谷氨酰胺消耗,可能会导致葡萄糖与谷氨酰胺等营养物质的相对缺乏[3]。这种情况在胰腺癌中尤其明显,胰腺癌中通常存在致癌基因Kras突变,导致癌细胞代谢重编程,消耗大量葡萄糖和谷氨酰胺以支持癌细胞旺盛生长[4-6]。因此,胰腺癌细胞的高代谢状态和胰腺癌组织的乏血管特征,必将导致特别是由葡萄糖和谷氨酰胺消耗引起的显著营养应激[7]。事实上,这种供需不平衡的矛盾状态不但提供了支持癌细胞快速增殖所需的能量和代谢物的途径,而且使得癌细胞对包括缺氧和能量缺乏在内的营养应激具有适应甚至抵抗能力[8]。有研究报道,当具有野生型KRAS等位基因的细胞在经受低萄糖环境时,虽然很少有细胞存活,但是存活的细胞大多数表达高水平的GLUT1,并且这些存活细胞中有4%获得了新的KRAS突变,这些数据表明葡萄糖剥夺可以驱动人类肿瘤中KRAS基因突变。因此,营养应激可能是导致KRAS基因突变的有利环境[9]。有研究结果显示,葡萄糖剥夺增加前列腺癌中VEGFmRNA的稳定性,这有助于促进肿瘤血管生成[10]。此外,Dejure及其同事的研究结果表明,谷氨酰胺剥夺的营养应激,只能抑制结肠癌细胞的增殖,并不能杀死了他们[11]。值得注意的是,肿瘤患者本身的营养缺乏状态与患者生存率低相关,但是并不影响肿瘤在体内的生长,这表明人体的营养不良状态,不但不会抑制肿瘤的生长以及远处转移,甚至可能使肿瘤细胞更强壮[12]。因此,研究胰腺癌如何通过自身代谢重编程作用,以适应营养应激的微环境及其分子机制,对胰腺癌患者治疗的策略的改进至关重要。

国内外研究现状及发展动态分析

反义长链非编码RNAAntisenselncRNAs)是从与蛋白质编码基因或非蛋白质编码基因的有义链对侧链转录而来。最近的研究结果表明,反义长链非编码RNAAntisenselncRNAs)在细胞内作用机制多种多样,涉及细胞功能调控的各个方面。这些AntisenselncRNAs通过一系列复杂的机制与细胞中DNARNA,蛋白质分子或它们的复合体相互作用,在转录前,转录过程中以及转录后的各个水平,调控基因的表达,从而影响细胞内的生物学功能。反义长链非编码RNA作为染色质结构和其转录及转录后功能的重要调控分子,它们的异常表达与疾病的发生发展相关。

研究结果显示,人类基因组只有大约2%的基因转录成熟的蛋白质编码RNA,而其中的绝大多数(70-90%)被转录成非编码RNAsncRNAs)。ncRNA种类繁多,按照目前的分类有转移长链非编码RNAlncRNAs),小RNAmicroRNAs),转移RNAtRNAs),核糖体RNArRNAs),小核RNAsnRNAs)和与Piwi蛋白相作用的piRNAs[1-5]等。长链非编码RNA是大小超过200个核苷酸的一类非编码RNA,除了缺乏蛋白质编码潜力外,非编码基因在进化上还具有相对保守性,具体表现为通常它们来源于比蛋白质编码基因短的基因,而且包含外显子序列较少[167]。另一方面,它们与蛋白质编码基因又具有某些相似性。例如,他们是通常也是由RNA聚合酶II转录,并且在转录后存在戴帽,加尾和剪接过程[89]LncRNAs的亚细胞定位可以在细胞核或细胞质,定位于细胞核的lncRNAs是参与表观遗传调控的重要分子[10-12]。而在细胞质中的长链非编码RNA通常通过影响胞质中的mRNA的稳定性,翻译活性[13-15],或影响结合蛋白稳定性[16],或者通过竞争性结合miRNA[17-19]等方式发挥作用,调控目标基因的表达。反义长链非编码RNAAntisenselncRNAs)定义为来自蛋白质编码基因或有义链的对侧链转录的没有蛋白质编码功能的RNA[20]。反义长链非编码RNA最初是在细菌中发现的[21]。在细菌中报道反义转录产物后不久,在真核生物中也发现并报道了数十个例子[22]。近年来,随着基因组高通量测序的方法用于科学研究,反义长链非编码RNA才在一系列物种的基因组中陆续大量发现[23-25]。一些研究表明,超过30%的基因具有反义长链非编码RNA,其中大多数表达水平低于其对侧有义链转录的RNA[2627]。码蛋白质的mRNA通常大部分积聚在细胞质中,然而,研究发现,与mRNA不同,反义长链非编码RNA在细胞核中富集较多[28]。总体来说,反义长链非编码RNA通过顺式调控作用或者反式调控作用两种方式起作用发挥其生物学功能。顺式调控作用是指,反义长链非编码RNA与从其相同的DNA区域的基因相互作用,主要是调节基因的转录;而反式作用是指,反义长链非编码RNA与位于远处的基因座甚至是其他染色体DNA或者RNA序列相互作用[2930]。反义长链非编码RNA的功能非常复杂而且多样化,它们可以在基因表达的各个阶段促进或者抑制靶基因的表达水平,如X染色体失活[3132],基因印迹[33]DNA或者组蛋白的修饰等表观遗传调控[122934];同时,反义长链非编码RNA通常可以在mRNA合成过程的任意步骤中影响靶基因的表达,包括RNA的转录、编辑、剪接,核膜转运,甚至是调控蛋白质的翻译过程[1035-37]。由于反义长链非编码RNA几乎在基因的每个调控水平都发挥作用,我们将从下面两个层次讨论其存在的作用机制:在转录水平,反义长链非编码RNA通过作为蛋白质的向导或者诱饵分子,参与DNA甲基化修饰或者组蛋白修饰等染色质重塑的过程,或者与转录因子或者DNA结合影响基因转录活性;转录后过程,主要通过RNA-RNA或者RNA与蛋白的相互作用调控靶基因的表达。

长非编码RNAlncRNA)是细胞内一类重要的转录产物,长度超过200nt,缺乏编码蛋白质的能力。越来越多的证据表明,lncRNAs在癌症中表达异常并参与肿瘤的发生发展[13]。具体而言,最近有很多研究报道了lncRNA与癌症中代谢改变之间的联系。例如:一项研究报道,肾癌和乳腺癌细胞在能量缺乏情况下,lncRNA NBR2LKB1-AMPK信号通路的调控下表达增加,lncRNANBR2反过来与AMPK相互作用并促进AMPK激酶的活性。因此,在能量应激期间,lncRNANBR2AMPK之间形成正反馈途径以增强AMPK信号通路的活化[14]。有学者在膀胱癌的研究中发现,LncRNA-UCA1可以通过激活mTOR-STAT3/miR143-HK2的级联反应,促进肿瘤细胞的糖酵解[15]Ellis及其同事的研究结果表明结直肠癌细胞中PI3K/Akt信号同路的激活,可以通过解除insulin/IGF信号通路对lncRNA-CRNDE表达的抑制作用,从而促进肿瘤细胞的有氧糖酵解[16]LncRNA-ANRIL在鼻咽癌中表达上调,并且通过增加葡萄糖摄取和糖酵解途径来促进癌症进展[17]。此外,lncR-UCA1被发现可以减少人类膀胱癌中活性氧(ROS)的产生和促进线粒体谷氨酸分解[18]。然而,目前尚未有研究报道与胰腺癌营养应激偶联的特异性lncRNA。在这项研究中,在胰腺癌中发现了一种参与胰腺癌进展的营养应激反应性lncRNA

谷氨酰胺酶(GLS)是一种磷酸盐活化的酰胺水解酶,可催化谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨,为生物提供能量和保持氮平衡,降低细胞中ROS浓度,以维持代谢稳态[19]。最近的研究表明,GLS在许多恶性肿瘤中通常高表达,并作为支持肿瘤细胞生长的致癌基因[2021]。研究报道,与周围非肿瘤组织相比,乳腺癌组织中GLS表达升高,并且升高程度与肿瘤分级呈正相关[20]。此外,在前列腺癌细胞中,GLS可以促进葡萄糖的摄取与三羧酸循环中的谷氨酸的利用率,从而发挥促进肿瘤生长的作用[21]。因此,在肿瘤细胞中敲低GLS表达可以显著抑制肿瘤细胞的生长和侵袭活性[22]Chakrabarti及其同事的研究结果表明,GLS在胰腺癌中表达显著上调,从而促进胰腺癌谷氨酰胺代谢途径[23]

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2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题(此部分为重点阐述内容)

研究内容

1. 通过高通量测序分析筛选出胰腺癌组织(PC)与癌旁正常组织(NP)差异表达的lncRNAGLS-ASAK123493.1)作为研究对象。NorthernBlot实验检测lncRNAGLS-AS在胰腺癌组织、细胞中的表达;通过RNA荧光原位杂交技术(RNA-FISH)明确lncRNAGLS-AS在胰腺癌细胞系BxPC-3PANC-1中的亚细胞定位。收集武汉协和医院胰腺癌患者手术标本,包括PC和与之对应的NP组织30对;使用荧光定量PCR技术检测lncRNAGLS-ASGLSmRNA的表达。

2. 在胰腺癌细胞系BxPC-3PANC-1细胞中转染lncRNAGLS-AS的小干扰RNA或过表达质粒。通过MTT实验、平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖活性;划痕实验、Transwell实验分别检测细胞的迁移,侵袭能力。再使用慢病毒包被lncRNAGLS-AS的小干扰RNA,包被的慢病毒在转染PANC-1细胞后用于构建裸鼠异种移植瘤模型,以观察转染后细胞在体内生长、转移能力的改变。

3. 用荧光定量PCR技术检测胰腺癌细胞系在转染lncRNAGLS-AS的小干扰RNA或者过表达质粒后,以及30对胰腺癌组织中lncRNAGLS-ASGLSmRNA表达;同时用蛋白免疫印迹(WesternBlot)检测GLS蛋白水平。使用RNA原位杂交(RNA-FISH)与GLS蛋白免疫荧光共染,观察lncRNAGLS-ASGLS蛋白在胰腺癌组织与胰腺癌细胞系中共定位的情况。

研究目标

胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度极高的肿瘤,由于其组织具有高度纤维化及缺乏血管的特征,以及癌细胞内发生的一系列代谢重编程改变,使得胰腺癌至今几乎尚无有效的治疗方法。课题组前期研究过程中发现谷氨酰胺酶(GLS)的反义长链非编码RNAlncRNAGLS-AS)在胰腺癌中发挥着调控肿瘤发生发展的作用。同时,发现lncRNAGLS-AS在胰腺癌中的表达与肿瘤营养应激微环境相关。因此,本研究旨在将胰腺癌营养应激微环境与lncRNAGLS-AS联系起来,逐步揭示lncRNAGLS-AS调控GLS表达的机制,及其如何通过c-Myc/GLS通路在营养应激微环境中介导胰腺癌细胞代谢重编程,以此为胰腺癌的治疗提供新的思路以及理论基础。

拟解决的关键科学问题

1. 针对lncRNAGLS-ASGLS前体RNAGLSpre-mRNA)分别设计RNA探针,使用RNA荧光原位杂交技术对lncRNAGLS-ASGLSmRNA在胰腺癌细胞中的共定位进行检测。通过体外转录技术人工合成lncRNAGLS-AS的不同部位片段,并用生物素标记,进一步用RNApulldown技术探究lncRNAGLS-ASGLS前体RNAGLSpre-mRNA)的结合位置。α-鹅膏蕈碱阻断胰腺癌细胞系RNA合成后,观察转染lncRNAGLS-AS小干扰RNA或者过表达质粒对GLSpre-mRNA稳定性的影响。利用蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)证明ADAR1Dicer在胰腺癌细胞中结合。RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)证明ADAR1/Dicer蛋白复合体与GLS-AS/GLSpre-mRNA双链RNAdsRNA)复合体结合。在胰腺癌细胞系中分别使用小干扰RNA敲低ADAR1Dicer表达后,荧光定量PCR检测lncRNAGLS-ASGLSpre-mRNA表达水平,以及α-鹅膏蕈碱处理上述转染细胞后GLSpre-mRNA的稳定性;WesternBlot检测转染细胞中ADAR1DicerGLS蛋白水平。

2. 体外模拟胰腺癌组织微环境,包括低氧、酸性、低糖以及低谷氨酰胺,荧光定量PCR检测lncRNAGLS-AS的表达,探究lncRNAGLS-AS在胰腺癌中低表达的驱动因素。RNA荧光原位杂交检测低糖、低谷氨酰胺环境下lncRNAGLS-AS的表达水平。荧光定量PCRWesternBlot检测低糖、低谷氨酰胺环境中GLSmRNA及蛋白的表达。

3. WesternBlot检测低糖、低谷氨酰胺环境中c-Myc蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀(ChIP)验证c-Myc蛋白与lncRNAGLS-AS上游启动子结合序列。双荧光素酶报告基因检测c-Myc蛋白对lncRNAGLS-AS启动子转录活性的影响。

4. LncRNAGLS-AS的慢病毒载体转染BxPC-3细胞系,以慢病毒空载体作为阴性对照(LV-Vector),构建裸鼠异种移植瘤模型,观察lncRNAGLS-AS过表达在体内对肿瘤生长、转移的影响。

            

3.拟采取的研究方案及可行性分析(包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明);

研究方法

研究对象

研究中涉及的患者临床手术标本从医院胰腺外科获得。获取标本前与病人及家属充分沟,病人及家属表示同意,并签署知情同意书。计划随机选取30例胰腺癌患者的肿瘤组织以及与之配对的癌旁组织,所选取患者术前未接受化学治疗或者放疗。根据美国NCCN胰腺癌治疗指南,对患者选取相应合适的治疗方案,包括胰腺十二指肠切除术或者I125粒子植入、胃肠吻合和胆总管空肠吻合等姑息手术。手术标本通过包括手术切除获得或者胰腺组织活检两种途径获得。在研究过程中涉及违反赫尔辛基宣言的地方。并且研究获得医学研究伦理委员会批准。本研究所使用的胰腺癌细胞系PANC-1BxPC-3计划均购自于美国模式培养物集存库(ATCC)。

6.实验方法

6.1细胞培养

正常条件下胰腺癌细胞在37℃和5CO2环境中培养,使用完全培养基,完全培养基由90RPMI1640Gibco),10FBSGibco)组成,其中青霉素和链霉素的浓度为:100U/mL青霉素,和100mg/mL链霉素。一般使用T25细胞培养瓶培养细胞,每次加4mL培养基,每隔2-3天换一次细胞培养液。细胞贴壁生长,若覆盖瓶壁80%-90%空间时候,则进行细胞传代操作,其方法为:去掉细胞培养基,使用无菌PBS溶液冲洗细胞,去掉残留培养基。接着加入2mL浓度为0.25%的胰酶,37℃条件下消化细胞约5min左右,待细胞轮廓消失变圆后加入2mL含血清的的完全培养基,然后将细胞吹打至脱落,收集细胞悬液,离心后取少量细胞回种至培养瓶中,便完成一次传代。为长期保存细胞,通常需要冻存细胞,其方法为:取对数期生长的细胞,按照之前细胞传代的方法操作至细胞离心去上清后。重悬细胞应使用细胞冻存液,我们的细胞冻存液配制方法为90%的胎牛血清加入10%的二甲基亚砜(DMSO),重悬后将细胞吹打均匀,再将细胞悬液吸出到冻存管中,依次在4℃,-20℃环境中各存放1h,然后加入到液氮罐中保存。冻存的细胞的复苏步骤为:取出细胞冻存管,在37℃中快速解冻细胞冻存液,加入约10mL新鲜培养基,低速离心后丢弃出上清,将细胞接种到新鲜培养基中,放入细胞培养箱,第二天应更换一次细胞培养液,以去除未贴壁的悬浮细胞。

建立细胞营养应激模型,谷氨酰胺剥夺模型[Glutamine-],我们用不含谷氨酰胺的完全培养基培养细胞;葡萄糖剥夺模型[Glucose-],我们从Gibco购买不含葡萄糖RPMI1640培养基,人为添加葡萄糖至浓度1mmol/L

6.2细胞转染

1.接种细胞:将细胞用胰酶消化后,含血清培养基重悬,细胞计数,将细胞按照约50000/孔的密度接种至12孔细胞培养板。将细胞培养板放置入培养箱,第二天细胞贴壁后再进行转染操作。

2.1.6ug需要转染的质粒或者40pmol的小干扰RNA溶解在100uL不含血清的Opti-MEM培养基中,用枪头轻柔混匀,室温放置5min

3.同时将4ul转染siRNA时候用量为2uL)转染试剂Lipofectamine2000溶解于100uL不含血清的Opti-MEM培养基中,同样用枪头混匀,室温放置5min

4.将第二步和第三步中的两管溶液充分混合,然后室温条件下放置约20min。同时将需要转染的12孔板细胞,去除含血清培养基,加入800uL不含血清的Opti-MEM培养基。

5.将上一步的混合液200uL加入到需要转染的12孔板内,使最终体积为1mL,此时应轻柔摇动细胞培养板以避免局部浓度过高造成细胞毒性。转染细胞在培养4-6小时后,应去掉培养基,换上含血清的完全培养基。

6.在换培养液后的48-72小时后,可根据需要提取转染细胞的蛋白或者RNA进行表达检测,或进一步验证转染后对细胞功能的影响。

6.3MTT实验

1.将转染后的细胞消化后接种在96孔板中,每孔100uL培养基,接种细胞数目为3000/孔,每个处理组至少5个复孔,与种植细胞孔边缘相邻板孔加入100uL无菌PBS,防止边缘孔因蒸发导致细胞中培养基减少,影响实验结果。

2.将细胞培养15天后,每天处理一块细胞培养板,将20uLMTT溶液(5mg/mL)加入到96孔板含有细胞的培养基中,并将细胞在37℃下继续培养4小时。然后,弃去培养基,每孔加入150uL二甲基亚砜(DMSO),在脱色摇床上避光振荡10min左右,直到所有沉淀溶解。

3.使用多功能酶标仪分别在490nm570nm波长测量DMSO的吸光度,在无细胞孔中加入等量DMSO做空白对照,记录数值。

4.在接下来的2-5天将其他培养板按照同样的处理方法记录OD值,以横坐标为时间轴,纵坐标以第1天数值作为相对值“1”,绘制细胞增殖曲线,取复孔之间的平均值,每个实验应重复三次。

6.4克隆形成实验

1.取处理后需要对比增殖能力的细胞,待其在对数生长期时,用0.25%的胰酶消化,完全培养基重悬,吹打成单细胞悬液,并进行细胞计数。

2.接种细胞至6孔细胞培养板,使细胞密度为每孔500个,摇匀,使接种的细胞在培养基中均匀分布,将细胞在培养箱中继续培养2-3周。

3.每天观察细胞的生长状态,直至细胞生长出现肉眼可见的克隆后停止。去除培养基,PBS洗净细胞,用4%多聚甲醛固定30minPBS洗三次,晾干后用0.1%的结晶紫染色20-30分钟,PBS洗净多余的结晶紫。

4.在显微镜下计数克隆数目,并且拍照记录实验结果。

6.5划痕实验

1.细胞培养板画线:在直尺帮助下,用记号笔在6孔板后面每隔0.5cm划直线,每条直线均穿过同一横排的3个培养孔。

2.接种细胞:在6孔板每个孔中接种5*105个细胞,让细胞贴壁后能均匀铺在6孔板底。

3.细胞划痕:用消毒灭菌后的直尺做依托,尽量垂直于板底标记笔所画直线,用10uL的小枪头做细胞划痕。

4.细胞划痕后,用PBS洗净悬浮的细胞,换上含1%胎牛血清的完全培养基,分别于0h12h24h48h时间点观察,拍照记录细胞划痕处迁移图像。

6.6Transwell细胞侵袭实验

1.铺基质胶:购买于美国BD公司的Matrigel,按照1:9的比例稀释,将Transwell小室放入24孔板中,取40uL包被于Transwell(孔径为8um)小室底部,应注意避免气泡产生。将铺胶后Transwell小室放置于细胞培养箱中放置4h,使液体胶聚合形成固体凝胶。

2.水化基底膜:Transwell小室在接种细胞前,应去除表面凝固后多余的液体,然后每孔加入50uL无血清培养基,放置于37℃孵育半小时,去除残留液体。

3.接种细胞:胰酶消化目标细胞,制备细胞悬浮液,应注意细胞重悬时候应用无血清培养基,对悬浮细胞进行计数,调整细胞密度至5*105/ml。往水化好的Transwell小室上室中加入100uL细胞悬液,使每孔接种细胞数为5*104个。在放置Transwell小室的24孔板内加入600uL30%胎牛血清的完全培养基,应注意避免产生气泡,以免影响实验结果。

4.培养细胞:将上述处理的细胞放入细胞培养箱(37℃,5%CO2浓度),继续培养12h

5.固定、染色:将上述细胞连续培养12h后,取出小室,用4%的多聚甲醛固定细胞30min。甲醛固定细胞后将小室放置超净台风干,然后用0.1%的结晶紫染色30min,冲洗干净小室,应避免将小室下层膜上细胞洗脱。用棉签擦小心去小室上室未穿过膜的细胞,将小室放置在显微镜下观察,100倍视野,取五个视野计数、图像拍照。

6.7蛋白免疫印迹(WesternBlot

1.主要试剂准备

1.110x电泳液配制:

分别称取Trisbase30.3g,甘氨酸144.2gSDS10g;加双蒸水(ddH2O),在磁力搅拌器上溶解,定容至1L,使用时直接用ddH2O稀释至1x

1.210x转膜液配制:

分别称取甘氨酸144.1gTrisbase30.3g,加ddH2O,磁力搅拌器溶解,定容至1L1x转膜液配制:取100mL10x转膜液,加入150mL甲醇,定容至1L

1.3SDS聚丙烯酰胺凝胶配制:

SDS制胶试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司,参照说明书,我们的研究一般采用8%的分离胶,总量为15mL时,配方为:ddH2O7mL30%丙烯酰胺(29:14mL1.5MTris-HClpH6.83.75mL10%SDS150uL,过硫酸铵(AP150uL,四甲基乙二胺(TEMED7.5uL。我们一般使用浓度为5%的浓缩胶,当总量为6mL时,配方为:ddH2O4mL30%丙烯酰胺(29:11mL1.5MTris-HClpH8.81mL10%SDS80uL,过硫酸铵(AP60uL,四甲基乙二胺(TEMED8uL

2.蛋白样品提取

2.1组织蛋白提取

2.1.1研磨组织:准备研钵、液氮,将收集在液氮中存放的组织取出后,切取一部分,趁组织块还未解冻,边研磨边加入液氮使组织块变得脆硬,最后将组织研磨成粉状。

2.1.2配制细胞裂解液:按需要量配制RIPA裂解液,在使用前数分钟按说明书比例加入蛋白酶抑制剂PMSFCocktail(如1mLRAPA裂解液中加入100xPMSF10uL50xCocktail20uL)。

2.1.3将配制好的RIPA蛋白裂解液加入到研磨好的组织中,按照每250mg组织加1mLRIPA裂解液的比例。

2.1.4待裂解液充分裂解组织蛋白后,在预冷的高速低温离心机中4℃,12000rpm,离心5min,取上清,即得组织蛋白,可用于WesternBlot实验。

2.2细胞蛋白提取:

2.2.1按照需要量配制RIPA蛋白裂解液。2.2.2丢弃细胞培养基,用PBS洗三遍,去除残留血清,将RIPA裂解液加入到细胞中(6孔板160uL/well12孔板80uL/well),将样本放在冰上,裂解半小时。

2.2.3用细胞刮收集裂解产物,将裂解产物收集到1.5mLEP管中,12000rpm4℃离心10min,收集上清,即为细胞总蛋白。

2.3蛋白样品浓度测定

2.3.1配制标准蛋白:

BCA蛋白浓度测定试剂盒购自于中国碧云天。根据说明书配制标准蛋白,浓度为25mg/mL2.3.2配制工作液:

工作液AB按照50:1的比例配制,注意尽量现配现用,室温储存时间不超过24小时。2.3.3测定蛋白浓度:取一块96孔板,将标准蛋白按照0uL1uL2uL4uL8uL12uL16uL20uL的量依次加到96孔板中;待测样本各取2uL加到96孔板中;不足20uL的孔,应加稀释液补足。然后向每个待测样品孔,以及标准品孔各加入200uL配制好的工作液。放在37℃环境中孵育30min,使用多功能酶标仪在560nm测定吸光度。

2.3.4根据标准品测出的OD值与对应蛋白量在Excel表格中绘制标准曲线,并得出蛋白浓度计算公式,再根据待测样品的吸光度OD值,计算出待测样品浓度。

2.4实验操作步骤

2.4.1样品准备:从组织和细胞提取的总蛋白按照4:1的比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X);然后将装蛋白的EP管在沸水中煮5-10min,使蛋白变性。

2.4.2配胶:根据说明书配制好分离胶与浓缩胶,过硫酸铵(AP)与四甲基乙二胺(TEMED)应在灌胶前最后加入,每面胶加5.5mL分离胶,2.5mL浓缩胶。根据需要选择10孔或15孔数梳齿。

2.4.3电泳:待测样品按30ug/孔的上样量,待测样品两端应加入蛋白Marker。浓缩胶电泳电压为80V,待到溴酚蓝完全进入分离胶,可调大电压至100V

2.4.4转膜:待溴酚蓝达到分离胶底部时,停止电泳。按照如下图顺序放置滤纸、含蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶、NC膜。转膜时候保持电流恒定为300mA,根据分子量大小决定转膜时间,一般在90min左右。

2.4.5封闭:配制封闭液,封闭液由1xTBST1xTBS溶液中加入0.1%Tween-20)和5%的脱脂奶粉配制而成。待转膜完毕后,将膜放入封闭液封闭1.5小时。

2.4.6一抗孵育:封闭液封闭完NC膜后,在1xTBST中去除残余封闭液;根据Marker位置以及目标蛋白分子量切膜,敷上按说明书比例配制的一抗,4℃,过夜。

2.4.7二抗孵育:孵育完一抗后,用1xTBST洗膜3次,每次10min。室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗,90min

2.4.8显影:辣根过氧化物酶发光法,二抗孵育完后,1xTBST洗膜3次,每次10min。将新鲜配制的ECL发光液(A液、B1:1配制),均匀的滴到NC膜上,孵育2-3min,在CHEMIDOCXRS+成像系统中成像并保存结果。

6.8RNA凝胶电泳和印迹(NorthernBlot)

操作步骤主要试剂来源于RocheDIGRNALABELINGKIT试剂盒

1.DNA模板制备:提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,根据杂交的目标片段设计引物,引物插入含T7T3或者SP6聚合酶启动子序列。PCR反应合成DNA模板,提纯DNA模板。

2.DIG-RNA标记:取1ugDNA模板,按顺序加入以下试剂:LabelingMix4uLTranscriptionBuffer4uLRNApolymerase2uLddH2O定容至20uL;混匀所有试剂,42℃反应1小时;加入1uLDNaeseI37℃孵育15min去除DNA模板;反应完成后,加入2uL0.2mmol/LEDTA,终止反应。

3.检测标记反应效率:取探针起始浓度为10ng/uLRNA探针标准品(DIG-labeledControlRNA)按照以下比例稀释

注:表格来源于DIGRNALABELINGKIT说明书。将已获得的标记RNA和上述3-10号管中各取1uL点样于带正电荷的尼龙膜上;烤箱12030minRNA固定在尼龙膜上;通过洗涤、封闭、敷抗体步骤后,使用碱性磷酸酶发光底物CSPD曝光尼龙膜,根据待测样品与标准品各点之间的亮度计算待测样品的浓度。

4. 配制NorthernBlot凝胶、电泳液

所需溶液配方

10x甲醛凝胶电泳(MOPS)缓冲溶液:200mMMOPS50mMNaAc20mMEDTANaOH调节pH=7.0

20xSSC溶液配方:氯化钠(NaCl175.3g,柠檬酸三钠88.2g,加水定容至1000mL,高压灭菌

马来酸缓冲液:0.1M马来酸(MaleicAcid),0.15MNaClNaOH调节pH值至7

洗涤缓冲液:马来酸缓冲液基础上加入0.3%Tween-20

检测缓冲液:0.1MTris-Hcl0.1MNaCl调整pH=9.5

封闭缓冲液:将试剂盒中10x封闭缓冲液稀释至1x

4.1配制2%甲醛变性凝胶:琼脂糖1.8g141.9mLMOPS,混合均匀,加微波炉中加热至琼脂糖完全溶解,然后加入37%甲醛8.1mL,混匀后灌胶。

4.1RNA样本中加入RNA上样缓冲液,枪头混匀,65℃变性10min,在无RNA酶的环境中电泳50V1小时;电泳结束后,在紫外下观察RNA完整性。

4.2RNA转膜与固定:转膜前在20xSSC中洗涤2次,每次15分钟;以20xSSC溶液为转膜液,采用毛细管虹吸印迹法转膜过夜,本实验使用带正电荷尼龙膜。转膜完成后,2xSSC中简单洗膜2次,120℃下烤尼龙膜30min

4.3杂交反应:配制杂交缓冲液DIGEasyHyb,加热到68℃,将尼龙膜放入杂交缓冲液中振荡30min;取新的杂交缓冲液DIGEasyHyb,加入地高辛标记的RNA探针(浓度约为100ng/mL),68℃下孵育过夜。杂交完成后用2xSSC0.1%SDS室温洗膜两次,每次5min,再用0.1xSSC0.1%SDS68℃下洗膜两次,每次15min

4.4免疫检测:将尼龙膜在封闭液中封闭30min;将碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-AP)按照1:10000的比例稀释,室温孵育尼龙膜30min;在洗涤缓冲液中洗涤两次,每次15min;接着将膜在检测缓冲液中平衡2-5min;将含RNA样品的膜面向上,向膜上滴加CSPD至完全浸润,室温孵育约5min,将膜放入杂交袋中,防止膜干燥;采用CHEMIDOCXRS+成像系统成像,曝光30min,保存图像。

6.9荧光定量PCR1.RNA的提取

1.1溶解细胞:在待提取RNA的组织或者细胞中加入Trizol,对于组织样本,黄豆大小的组织块,加1mLTrizol;对于细胞样本,12孔板细胞加入400uLTrizol6孔板细胞加入1mLTrizol。组织样本需要研磨器研磨至组织样本完全溶解(研磨器需高压灭菌,DEPC水处理),细胞样本在Trizol中约20min可完全溶解。

1.2两相分离RNA:在溶解了组织或者细胞的Trizol裂解液中按5:1的比例加入氯仿(1mLTrizol裂解液加入200uL氯仿),振荡器振荡30s,将氯仿与Trizol裂解液完全混匀。冰上静置20min,然后12000rpm4℃离心15min。离心后混合液分为三层,取上层水相液体转移至新的离心管中,应避免取到中间层以及下层液体。

1.3沉淀RNA:在取得的上层液体中加入等体积的异丙醇,以沉淀混合液中RNA。加入异丙醇后,轻柔混匀,静置15min,然后12000rpm4℃离心10min。通常可在离心管壁见到芝麻粒大小的白色沉淀,即为RNA

1.4洗涤RNA:去除上清后,加入DEPC水新配制的75%乙醇,每个样本1mL,洗涤RNA沉淀,47500rpm,离心5min,弃上清。

1.5小心吸取离心管内残留液体,在空气中干燥20min左右。待RNA完全干燥,肉眼可见RNA40uLDEPC水溶解,肉眼不可见者用20uLDEPC水溶解。提取的RNA保存在-80℃备用。

2.RNA浓度测定:使用NanoDrop分光光度计测量RNA样品的浓度与纯度。

3.逆转录cDNA合成:按照Takara货号为RR037A的说明书配制反应体系,如下表

注明:表格来源Takara货号为RR037A说明书,检测lncRNAGLS-AS表达时用Genespecificprimer。逆转录条件为:3715min逆转录合成cDNA(使用GeneSpecificPrimer时温度为42℃);855s灭活逆转录酶活性;4℃停止反应。

4.应用StepOnePlusReal-TimePCRSystemRealTimePCR反应体系配制GreenPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)2×)10uLPCR前引物0.8uLPCR后引物0.8uLROXReferenceDye0.4uLcDNA模板2uLddH2O6uL本研究所用到的qPCR引物序列如下表NamePrimerSequencesGLSForward:5-TCCAGAAGGCACAG-3Reverse:5-AGACCAGCACATCATACC-3LncRNAGLS-ASForward:5-AGCCATGGACTCAATCGGAC-3Reverse:5-CTCTAAACAGCACAGCCCCA-3GLSpre-mRNAForward:5-CAGAGGGTAATACAGGA-3Reverse:5-CAGGATATGGGAGACAGA-3c-MycForward:5-AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC-3Reverse:5-GTCGTTTCCGCAACAAGTCCTCTTC-3ADAR1Forward:5-GCCACTACCCTGTCTTCG-3Reverse:5-GACACCAGTTGACGCTTG-3DicerForward:5-TGCTATGTCGCCTTGAATGTT-3Reverse:5-AATTTCTCGATAGGGGTGGTCTA-3GAPDHForward:5-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3Reverse:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3

5.定量PCR反应程序

第一阶段:预变性9530s1个循环第二阶段:PCR扩增955s然后6030s40个循环第三阶段:溶解曲线从60℃逐步升温至951个循环

6.定量PCR结果分析:

每个标本做3个复孔,以每个标本GAPDH的表达作为内参,目的基因和内参基因的Ct值分别取均值。然后根据ΔCt=目的基因的Ct-Ct内参,分别计算实验组和对照组的ΔCt值;ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组,对照组与实验组的相对表达量=2-ΔΔCt

6.10免疫组化染色

1. 将组织石蜡切片置于60℃的烘箱中1小时,然后浸入二甲苯脱蜡两次,每次10分钟。

2. 用梯度酒精洗涤切片:100%,95%,80%,70%,每次5分钟,然后蒸馏水洗涤5分钟。3.然后将切片置于柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)中,加入微波箱中,在微波炉中加热至沸腾10分钟,然后从缓冲液中取出载玻片,用蒸馏水冲洗两次,然后用PBS冲洗。

3. 向每张切片中加入一滴3H2O2并在室温下孵育10分钟以阻断内源性过氧化物酶的活性。

5.PBS溶液洗涤切片,然后在4℃下与抗GLS1100)抗体4℃孵育过夜。

6.将载玻片与生物素化的抗-IgGCSTUSA)一起作为第二抗体在室温下孵育1小时。用PBS和蒸馏水进一步洗涤切片后,随后使用新制备的DAB溶液(二氨基联苯胺)直至组织切片适合观察。

6.18数据分析

所有结果均以均值±SD表示。两组之间差异的比较用t检验分析。LncRNAGLS-ASGLSmRNA之间的相关性使用皮尔森相关性(Pearsoncorrelation)分析。

技术路线

筛选出高表达或低表达的Smad         

R-Smad高表达                  Anti-Smad低表达

反义寡核苷酸阻断                  转染抑制型Smad载体

               

TGF-β1刺激气道平滑肌细胞

 

R-Smad的表达                      Anti-Smad的表达

技术路线图1 TGF-β1介导Smad信号通路的研究

                    MAPK抑制组

            Smad干预组

哮喘组

                   合用两者组

        

                   未干预组

正常组

技术路线图2 Smad信号通路与MAPK信号通路协同调控研究

技术路线:

                    早产大鼠高氧肺损伤模型

caveolae caveolin酪氨酸磷酸化状态

(免疫沉淀、免疫印迹)

     

Emmprin/MAPK p38                    TGF-β/SMAD

信号通路研究 信号通路研究

Emmprin、P38、磷酸化P38 TGF-β、TβR、SMAD、磷酸化SMAD

表达(免疫印迹与Northern Blot     表达(Western Blot和Northern Blot)

RT-PCR) TβRⅠ激酶活性(免疫沉淀和免疫印迹)

实验手段

主要仪器

力康HealForce台式高速冷冻离心机上海力康生物医疗科技控股集团台式常温低速离心机TD6K上海卢湘仪离心机仪器有限公司微孔板迷你离心机BE-6100海门市其林贝尔仪器制造有限公司MiniStar10K/12K微型离心机湖南恒诺仪器设备有限公司电子天平AL104梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司MultiskanSky全波长酶标仪美国ThermoFisherScientific赛默飞世尔HeracellCO2细胞培养箱160i美国ThermoFisherScientificNanoDrop分光光度计美国ThermoFisherScientificZHJH-C1112B豪华型垂直流超净工作台华晨乐天生物实验设备有限公司力康HFsafe-1200A2生物安全柜上海力康生物医疗科技控股集团HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司WGLL-125BE鼓风干燥箱天津泰斯特仪器有限公司立式高压蒸汽灭菌锅山东新华医疗器械股份有限公司赛默飞世尔900系列超低温冰箱美国ThermoFisherScientific对开门冰箱广东容声电器股份有限公司液氮罐查特生物医疗(成都)有限公司台式恒温摇床美国ThermoFisherScientific脱色摇床常州荣华仪器制造有限公司超声波细胞粉碎机中国宁波新芝生物科技有限公司Smart高纯水机(智能型)上海力康生物医疗科技控股集团DYY-6C型电泳仪北京六一生物科技有限公司DYCZ-24K双板垂直电泳仪北京六一生物科技有限公司DYCP-31C型琼脂糖水平电泳槽北京六一生物科技有限公司CHEMIDOCXRS+成像系统美国BIO-RAD公司温度梯度PCR仪德国WhatmanBiometra公司StepOnePlusPCR仪美国ThermoFisherScientific黑色载玻片湿盒江苏南通海门市康泰仪器厂olympus激光共聚焦显微镜日本奥林巴斯株式会社OlympusBX51荧光显微镜日本奥林巴斯株式会社OlympusCX31普光显微镜日本奥林巴斯株式会社

2.主要耗材

T25/T75细胞培养瓶无锡耐思生物科技有限公司细胞培养皿无锡耐思生物科技有限公司细胞培养板无锡耐思生物科技有限公司50ml反应管无锡耐思生物科技有限公司无菌细胞爬片无锡耐思生物科技有限公司荧光定量PCR96孔板美国ThermoFisherScientificEppendorf手动单道移液器一套德国EppendorfKirgen通用性移液器吸嘴(Tip)上海科进生物技术有限公司各种型号EP管上海科进生物技术有限公司绿色芦荟无菌手套海门市扬子医疗器械有限公司Transwell小室美国Corning公司

3.主要试剂

RPMI培养基1640美国GibcoOpti-MEM培养基美国Gibco胎牛血清(FBS)美国ScienCell公司青霉素-链霉素溶液中国碧云天转染试剂Lipofectamine2000美国ThermoFisherScientific质粒与慢病毒构建上海吉凯基因小干扰RNAsiRNA)广州市锐博生物科技有限公司Matrigel基底膜基质胶美国BD公司MTT细胞增殖检测试剂盒中国碧云天SDS-PAGE凝胶制备试剂盒武汉谷歌生物科技有限公司Amersham蛋白转印迹膜(NC膜)美国GEwhatman蛋白Marker美国ThermoFisherScientific兔抗GAPDH抗体美国CellSignalingTechnology琼脂糖珠ProteinA美国CellSignalingTechnology鼠抗Dicer抗体英国Abcam兔抗ADAR1抗体美国ProteintechWesternBlot二抗美国CellSignalingTechnology兔抗GLS抗体美国Proteintech免疫荧光二抗中国碧云天

qPCR逆转录与定量试剂日本Takara引物合成武汉擎科生物放线菌酮(CHX)中国碧云天MG-132Proteasome抑制剂中国碧云天地高辛Northern标记及杂交检测试剂盒瑞士RocheEZ-ChIP试剂盒美国merckmilliporeFISHTagRNAMulticolorKit美国ThermoFisherScientificRNA免疫共沉淀试剂盒(RIP)美国merckmilliporeRNApulldown试剂盒美国ThermoFisherScientificStreptavidin-coupledDynabeads

美国ThermoFisherScientific

4.患者资料

以及手术标本获得本研究中涉及的患者临床手术标本从武汉协和医院胰腺外科获得。获取标本前与病人及家属充分沟,病人及家属表示同意,并签署知情同意书。我们随机选取了30例胰腺癌患者的肿瘤组织以及与之配对的癌旁组织,所选取患者术前未接受化学治疗或者放疗。选取患者中有男性21例,女性9例,我们根据美国NCCN胰腺癌治疗指南,对患者选取相应合适的治疗方案,包括胰腺十二指肠切除术或者I125粒子植入、胃肠吻合和胆总管空肠吻合等姑息手术。因此,手术标本通过包括手术切除获得或者胰腺组织活检两种途径获得。我们在研究过程中未有涉及违反赫尔辛基宣言的地方。并且此项研究获得了华中科技大学(中国,武汉)医学研究伦理委员会批准。

5.细胞来源

本研究所使用的胰腺癌细胞系PANC-1BxPC-3均购自于美国模式培养物集存库(ATCC)。

关键技术

6.11蛋白免疫共沉淀(Co-IP

1.提取胰腺癌细胞总蛋白,测蛋白浓度,使用碧云天购买的WesternIP裂解液,稀释蛋白至1ug/ul2.按照每1mL蛋白60uL体积的琼脂糖珠比例,加入ProteinA琼脂糖珠,4℃摇晃孵育1小时,去除非特异性结合蛋白。3.500uL上一步的蛋白裂解液,加入1ug目的蛋白(本实验中使用anti-ADAR1/anti-Dicer)抗体,4℃摇晃孵育过夜。4.加入60uL体积的ProteinA琼脂糖珠捕获蛋白抗体复合物,加入琼脂糖珠后,4℃摇晃孵育1小时,离心,弃上清,得到沉淀即为琼脂糖珠、抗体、蛋白复合物。5.复合物用WesternIP裂解液洗涤三次,用50uL蛋白上样缓冲液重悬琼脂糖珠,沸水浴5-10min蛋白变性,即可用于WesternBlot检测实验结果。

6.12染色质免疫共沉淀(ChIP

1. 体内交联(细胞内):将37%的甲醛加入到培养基中,使甲醛终浓度为1%,室温孵育10min,加入10x甘氨酸,淬灭未反应的甲醛。

2. 裂解细胞:弃上清,用含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤细胞后,加2mL含有1xcocktailII的预冷PBS至细胞中,刮出细胞,离心收集细胞后加入含cocktailIISDS细胞裂解液。

3. 超声破碎DNA4-510秒脉冲,使交联的DNA,破碎成长约200-1000个碱基对的DNA片段。

4.免疫共沉淀(IP)交联的蛋白质/DNA复合物:取100uL超声破碎后的DNA,稀释至1mL,加入60μL的蛋白G琼脂糖,4℃振荡孵育1小时,4000rpm,离心后保留上清,去除与琼脂糖非特异性结合蛋白。实验组加入目标抗体1ug,阴性对照组用IgG抗体,4℃,孵育过夜,然后加60uL蛋白G琼脂糖,振荡孵育1小时,4000rpm离心收集蛋白G-抗体-抗原-DNA复合物。

5.洗涤蛋白G-抗体-抗原-DNA复合物:低盐洗涤缓冲液,洗1次;高盐洗涤缓冲液,洗1次;氯化锂洗涤缓冲液,洗1次;TE缓冲液,洗2次。

6.洗脱蛋白质-DNA复合物:每个样品需要200uL的洗脱缓冲液:10uL20%SDS溶液,20uL1mol/L的碳酸氢钠和170uL的无菌蒸馏水。加入洗脱缓冲液后,混匀,孵育15min4000rpm,离心后收集上清。

7.解交联蛋白质/DNA复合物:上一步的上清中加入8uL5mol/LNaCl65℃水浴锅孵育5小时;加入RNA酶,37℃下孵育30分钟;紧接着加入4uL0.5mol/LEDTA8uL1mol/LTris-HCl1uL10mg/mL的蛋白酶K45℃水浴锅孵育2小时。

8.DNA纯化:按照1:5体积的比例加入DNAbindingBuffer,通过收集管离心将DNA吸附到收集管自旋过滤器中,洗涤DNA,使用50uL洗脱缓冲液洗脱过滤器滤网上DNA,就是纯化的DNA

9.ChIP结果检测:PCR检测配方:DNA2uLddH2O13.2uL10xPCRBuffer2uL2.5mmo/LdNTP1.6uL,目标片段前后引物各0.8ul(10mmol/L)Taq0.2uL5U/uL);PCR反应程序:943min预变性;紧接着30个扩增循环,条件为9420s变性,5945s退火,7230s延伸。

10.取上一步的DNA片段的PCR产物,配制2%的琼脂糖凝胶,DNA电泳观察实验结果。本研究用到的针对lncRNAGLS-AS启动子DNA序列的引物序列如下:

PrimerSequencesLncRNA-GLS-ASPromoterPrimer-1Forward:

5-GGCTGCTCTTTGAATA-3Reverse:5-TGGCACCTCCTTTG-3Primer-2Forward:5-GGAGGCTGCTGGAGTA-3Reverse:5-TTTGTCTTGGGTTGGT-3Primer-3Forward:5-AAAGGCAACCTTGACCCA-3Reverse:5-TCCCTCCATAATGTGAGC-3Primer-4Forward:5-TCAAATTATACAATGCACGAGG-3Reverse:5-TTCTGACAACGGGAAGGA-3

6.13RNA免疫沉淀(RIP)

1. 细胞准备:预冷PBS洗涤细胞两次,再加入适量PBS,细胞刮收集细胞,离心,得到细胞沉淀;使用适量RIP裂解液(RIPLysisBuffer)重悬细胞,枪头吹打均匀使细胞充分裂解;每管取200uL裂解液进行下一步实验。

2.磁珠抗体结合:取50uL磁珠,加入0.5mLRIPWashBuffer,短暂漩涡振荡后分离磁珠,重复两次;用100uLRIPWashBuffer重悬磁珠,向其中加入3ug目的抗体。室温条件下振荡孵育30min;磁力架分离磁珠,0.5mLRIPWashBuffer洗涤磁珠两次。

3.免疫沉淀磁珠/蛋白/RNA结合复合体:向磁珠/抗体复合物中加入100uL细胞蛋白裂解液,同时加入RIP免疫沉淀缓冲液(RIPImmunoprecipitationBuffer);4℃摇床孵育过夜;磁力架分离磁珠/蛋白/RNA复合体,弃上清,RIPWashBuffer洗涤3次。

4.RNA分离:向上一步提取的磁珠中加入107uLRIPWashBuffer15uL10%SDS18uLproteinaseK,总体积150uL55℃孵育30min,使蛋白充分消化,RNA从复合物上分离出来。

5.RNA纯化:上一步孵育完成后,取上清,加入250uLRIPWashBuffer,再加入400uL的苯酚:氯仿:异戊醇(试剂盒提供);4℃,12000rpm,离心10min;取上清350uL置于新的无酶离心管中;加入400uL氯仿,漩涡振荡,4℃,12000rpm,离心10min,取上清300uL;继续按照常规RNA提取步骤提纯RNA;最后用20uL无酶水(DEPC水)重悬。6.RNA检测分析:本研究中使用定量PCR检测。

6.14双荧光素酶报告基因检测启动子活性

1.构建质粒:将GLS基因与lncRNAGLS-AS基因转录起始位点上游启动子碱基作为目的片段克隆到pGL3载体质粒上,构建成荧光素酶报告质粒;同时突变其中感兴趣的片段,构建突变型(Mutant)荧光素酶报告质粒。

2.质粒转染:按照质粒转染的步骤将上述报告基因转染进入细胞,同时应转染携带海肾荧光素酶的质粒pRL-TK用作内参荧光。

3.检测:使用美国Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒,步骤如下:

3.1试剂准备:配制LuciferaseAssayReagentII(LARII)配制,将10mLLuciferaseAssayBuffer全部加入LuciferaseAssaySubstrate中,分装冻存于-80℃,每次按需求取用;使用前配制1xPassiveLysisBuffer(1xPLB),用ddH2O或者PBS稀释5xPassiveLysisBuffer1x。使用Stop&GloBuffer50xStop&GloReagent稀释至1x

3.2检测试验步骤:

使用96孔板培养细胞,每个样品设置5个复孔,转染后达到检测时间,去除待检测细胞培养基,1xPBS洗涤3次,加入配制好的1xPLB裂解液至细胞中,20uL每孔,室温轻柔摇动96孔板孵育30min,保证细胞完全充分裂解;每孔细胞裂解液中加入100uLLARII,稍微摇匀,使用多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性强度;每孔加入100uL1xStop&GloReagent,终止萤火虫荧光素酶反应,同时激活海肾荧光素酶活性;再次使用多功能酶标仪检测海肾荧光素酶活性,记录数值。

3.3结果计算:

启动子活性强度=萤火虫荧光素酶活性强度数值/海肾荧光素酶活性数值,取复孔平均值。

6.15RNA荧光原位杂交

该部分实验使用购买于美国ThermoFisherScientific公司的FISHTagRNAMulticolorKit试剂盒,按照如下步骤操作。

1.体外合成氨基结合的RNA探针:根据实验需要,确定探针标记的位置,设计引物,在下游引物根据需要选择插入T7T3或者SP6启动子,PCR合成探针的DNA模板,应使最终探针长度在500nt左右。按照以下配方体外转录合成RNA探针:试剂需要量ddH2O不含核酸酶加至总体积20uL5X逆转录缓冲液(T3/T7,或者SP64uL二硫苏糖醇(DTT1-2uL10XRNA核酸mix2uLPCR获得的线性DNA模板1ugRNaseOUTinhibitor1uLRNA聚合酶(T3T7或者SP61uL37℃孵育1小时,然后加入1ulDNase37℃孵育15min,分解DNA模板,加入79uL无酶水剧烈振荡10s,灭活DNase。然后,马上进行RNA提纯:加400ulBindingbuffer进入上述反应管中,按照离心柱提取核酸的步骤提取RNA,最后收集管中得到的便是提纯的胺基结合的RNA

2.染料标记结合氨基的RNA探针:将1ugRNA65℃水浴锅变性5min,然后置于冰上,加入试剂盒中准备的碳酸氢钠溶液3uL。将染料用2uLDMSO溶解,加入到RNA中,室温避光孵育1h,然后使用试剂盒提供的方法与试剂提纯RNA,提纯的RNA可直接用于荧光原位杂交实验,应避光保存在-80℃冰箱。

3.RNA荧光原位杂交实验

3.1预杂交:常规固定样品,0.5%TritonX-100透化处理样品,根据样品(组织或者细胞)种类不同,可选择浓度在5-50ug/ml之间的蛋白酶K处理样品。然后使用预先配制好的预杂交缓冲液55℃预杂交样本1小时。预杂交缓冲液的配方为:50%甲酰胺与5XSSC,杂交液中破碎的鲑鱼睾丸DNA浓度为100ug/ml,肝素浓度为50ug/mLTween-20浓度为0.1%

3.2杂交:将RNA探针溶解于杂交缓冲液中,使其浓度为1ug/ml,探针孵育前应在80℃水浴锅中变性2min,然后置于冰上5min,然后去除样品中的杂交缓冲液,加入含探针的杂交缓冲液,55℃孵育16-20小时。

3.3杂交后:收集探针/杂交缓冲液,冻存于-20℃,探针可反复使用数次。使用预杂交缓冲液,在55℃洗涤杂交后样品两次,每次半小时。再用50%PBT50%杂交缓冲液混合液室温孵育10min,然后PBT溶液漂洗3次,每次5分钟。在样品表面滴上抗淬灭封片剂,盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察。

6.16RNA-RNApulldown实验

1.根据所需要转录的RNA序列设计引物,并将体外转录所需的T3/T7/SP6启动子插入到引物中,PCR合成DNA模板。按照体外转录的步骤使用合适的RNA聚合酶(T3/T7/SP6)合成目的RNA,提纯合成的RNA2.生物素标记RNA:取5uLRNA,为打开RNA的二级结构,加入2uLDMSO溶液,在反应管中,85℃水浴5min,置于冰上。按照下列体系配制标记液:10xRNA连接酶反应液3uLRNA酶抑制剂1uL,生物素化二磷酸胞嘧啶1uLT4RNA连接酶2uL30%聚乙二醇15uL,未标记RNA5uLddH2O3uL。混匀上述反应体系,PCR仪内16℃孵育4h或过夜。待上述反应结束后,加入70uL无核酸酶的ddH2O

3.提纯生物素标记的RNA:向每个反应中加入100uL试剂盒中的氯仿:异戊醇,以提取生物素化标记的RNA。振荡混合物,在4℃,12000rpm离心5min。收集上层水相液体(内含RNA),并转移至无核酸酶的试管中;加入10uL5mmol/LNaCl1uL糖原和300uL100%乙醇,在-20℃下沉淀≥1小时;在4°C下以12000rpm,离心15min,弃上清,保留沉淀,70%乙醇洗涤提纯的RNA,晾干后加20uLddH2O溶解。

4.使用生物素标记的RNA进行RNA-RNApulldown实验

4.1准备细胞裂解液。

4.2清洗链霉亲和素偶联的磁珠:使用试剂盒提供的洗涤液BindingandwashingBuffer(2X),将磁珠洗涤2-3次,使磁珠能更好的跟生物素标记的RNA结合。

4.3磁珠与生物素化RNA结合:向洗涤后的磁珠中加入200uLBindingandwashingBuffer2X()浓度为5ug/uL),加入20uLRNA,加380uLDEPC水定容至800uL。室温轻柔振荡孵育30min,使磁珠与生物素化RNA充分结合,用磁力架分离磁珠/RNA复合物,弃上清,BindingandwashingBuffer2X)洗涤3次。

4.4目标RNA与磁珠/RNA复合物结合:将提取的细胞裂解液加入到上一步已处理好的磁珠中,同时加入RNase抑制剂;4℃旋转振荡2小时使磁珠与细胞裂解液充分接触;磁力架分离磁珠,弃上清,得到磁珠/RNA复合物与目标RNA的结合体;按照步骤提取RNA,然后NorthernBlot检测目标RNA

6.17裸鼠异种移植瘤模型

1. 细胞准备:将细胞分别转染实验组与对照组慢病毒,嘌呤霉素筛选并鉴定稳定表达的细胞株,将细胞接种到培养瓶中,使用T75的培养瓶准备种植瘤所需细胞。

2. 裸鼠准备:从北京华阜康生物科技股份有限公司购买裸鼠,雄性,6周龄,随机分为对照组与实验组,每组6只;裸鼠应在新环境中喂养3-5天再接种细胞。

3.接种细胞:皮下种植瘤:裸鼠接种部位皮肤用75%酒精消毒,用1mL注射器吸取100uL细胞悬液(4*106个细胞),将细胞注射至小鼠背部皮下;转移瘤:吸取200uL细胞悬液(1*106个细胞),将细胞经尾静脉注入小鼠体内。

4.观察、记录实验结果:每日观察小鼠的饮食、活动以及皮肤健康状态,每隔3天用游标卡尺记录肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线,肿瘤体积计算公式V=0.5*(length)*W2(width)3周时处死小鼠,剥离种植瘤,取小鼠肿瘤组织提取RNAPCR检测感兴趣指标变化;观察转移瘤模型小鼠的肝脏、肺组织,进行H&E染色。

3.本项目的特色与创新之处;

(1)将呼吸学与病理学、病理生理学、分子生物学和中西药物学交叉结合,体内实验和体外实验相结合进行重大疾病的研究;

(2)率先探讨Smad信号通路在哮喘中的作用,探讨其与MAPK信号通路是否协同调控TGF-β,协同参与气道重塑,通过气道平滑肌细胞培养和体外干预实验研究证实;

(3)首次研究牛膝多糖和丁地去炎松对Smad信号通路和气道重塑的影响,并为 牛膝多糖在儿童哮喘中的应用提供实验依据,对于完善儿童哮喘治疗方案具有重要意义。

5.年度研究计划及预期研究结果(包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等)。

2006.1— 2006.12  观察哮喘大鼠Smads表达情况,探讨其与气道重塑的关系;

2007.1— 2007.8   TGF-β1介导Smad信号通路的研究

2007.9—2008.6    Smad信号通路与MAPK信号通路协同调控的实验研究

2008.7—2008.12   总结、申请鉴定和成果报奖。

【预期研究成果】

(1) 阐明TGF-β/Smad信号通路在哮喘气道重塑中起着重要作用;

(2) 阐明哮喘发病中Smad 信号通路与MAPK信号通路具有协同作用,协同调控TGF-β;

3) 揭示牛膝多糖、丁地去炎松对Smad信号通路具有调控情况,参与调控气道重塑。

利用研究结果的计划

争取在国内核心期刊、国外杂志上发表论文5-6篇(SCI1-2篇),参加全国会议和国际会议交流并进行推广。申请成果鉴定并以科研成果申报省级医学科技进步奖或省级科技进步奖。通过研究成果将深化哮喘发病理论,阐明药物作用机制。

理论上的创新:

研究Emmprin/MAPK p38信号通路在器官发育和组织病理损伤中的作用,国内外尚无文献报道。

本课题研究caveolin对Emmprin/MAPK p38、TGF-β/SMAD共调节机制,将为早产儿高氧肺损伤发病机制开辟新的研究领域,并为其防治开拓新思路。

方法上的创新:

以在体组织为研究对象,应用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜技术研究caveolin/Emmprin、caveolin/TβRΙ共定位,国内外未见文献报道,可望为深入研究小窝蛋白对信号转导的调控机制开辟新途径。

年度研究计划及预期研究结果。

年度研究计划及预测进展

  本课题研究内容预计用3年时间完成.

   2004年1月~8月

①购买所需试剂。②建立预实验动物模型。③进行各项预实验。

   2004年9月~2005年2月

①建立动物模型。②完成标本的收集。

   2005年3月~7月

                完成MMPs、TIMPs、TGF-β、TβRΙ、SMAD2及其mRNA表达的研究,并进行阶段性总结。

   2005年8月~2005年12月  

             完成caveolin-1表达和caveolin-1/TβRΙ共定位研究,并进行阶段性总结。

   2006年1月~2006年6月

       完成caveolin-1的酪氨酸磷酸化状态研究,并进行阶段性总结。

   2006年7月~12月  

研究数据资料分析、总结、论文撰写及成果鉴定。

 预期研究成果

本项目所建立的早产新生大鼠慢性高氧肺损伤模型,不仅为本课题提供了研究对象,而且为研究高氧肺损伤后肺ECM重建提供了模型。

本研究可望为阐明早产儿高氧肺损伤机制提供新的线索:⑴高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加,ECM重建紊乱的主要原因。⑵高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常,从而影响Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合,继而导致MMPs增加,ECM重建紊乱。本研究内容也可能为预防和干预高氧肺损伤提供理论依据。

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