在生物地球化学模型中加入反硝化酶动力学的显式是准确模拟N₂O生成和还原动力学的一种很有前途的方法。为了更好地预测亚热带森林土壤氧化亚氮(N₂O)在土壤中的产生和消耗，本项目拟建立一个考虑预合成酶和新合成酶结合的显式反硝化模型，以提高土壤N₂O排放预测准确性。

（可附页）

（一）研究背景与意义

氧化亚氮(N₂O)是一种长期存在的温室气体，对臭氧层的破坏起着重要作用。目前，人类对地球生态系统氮循环的扰动，使得目前大气N₂O浓度以每年0.8ppb的速度增长^[1]。地球表面的土壤是N₂O排放的最大贡献者，大约6.0Tgyr-1来源于自然土壤，4.2Tgyr-1来自农业土壤^[2]，占全球人为N₂O来源的50%。施用合成氮肥大大促进了农业生态系统N₂O的排放。在硝化的示踪剂研究中观察到N₂O是硝化的主要产物，反硝化是N₂O的一个比硝化更重要的来源。土壤中N₂O的产生在现有的反硝化模型中是以微生物的生长为基础的，反硝化代谢模型是基于双底物和利用单细胞生长动力学建立的，没有考虑酶促反应动力学，而酶反应是比种群更敏感组织层次。为了更好地预测N₂O在土壤中的积累和排放，本项目拟开发建立一个预合成酶和新合成酶的反硝化生物调控酶显式反硝化模型，以提高对土壤中N₂O产量的预测能力，为缓解全球变暖提供理解工具。

（二）研究目标

主要目的是通过开发一个包含预合成酶和新合成酶的显式酶动力学的模型，改进对土壤中N₂O积累和排放的模型预测，提高对土壤中N₂O排放量的预测能力。以此来开发减源增汇措施，减少N₂0的排放，缓解全球变暖问题。

（三）研究内容

建立一个具有明确的酶动力学的反硝化的数学模型。1、定义一个酶活性函数(E)来估计活性酶的相对浓度和环境条件下的变化，并将前合成的反硝化酶的活性与新合成的酶活性区分开来。2、用土壤培养的实验数据对描述酶动力学的参数进行了估计和验证。

（四）国内外研究现状和发展动态

在反硝化过程中，氮氧化物的顺序还原通常采用Michaelis−Menten动力学模型，使用最大反应速率(Vmax)的酶比值(Vmax)和底物亲和力常数(Km)是反应速率为0.5Vmax的底物浓度^[3][4]。潘等人^[5]在Michaelis−Menten动力学表达式中引入还原和氧化电子载流子的去耦还原碳氧化和氮氧化物还原反硝化模型用不同的底物亲和常数来解释电子的竞争。

（五）创新点与项目特色

建立一个把预合成酶和新合成酶分开的具有明确的酶动力学的反硝化的数学模型，能改进对土壤中N₂O积累和排放的模型预测。

（一）说明与本项目相关的研究工作积累和已取得的工作成绩；

项目申请者为2017级生态学专业的同学，经过将近两年的学习已经具备一定的专业基础知识。已经学习过以及正在学习的课程主要有土壤学、植物生理学、自然地理学、生物化学、有机化学、无机化学等相关学科，能够较好的将在课本上学到的理论知识运用到该课题实践上。也在实验课过程中积累了许多实验经验，具备一定的实验技能，熟悉实验室相关仪器的使用方法。而且本人也积极参与到学姐学长的科研项目，经过较为系统的科研训练，已具有较好的实验基础，能够很好的完成实验目标。

项目指导高人教授是中科院南京土壤研究所博士后，生态学教授，英国阿伯丁大学访问学者。主要从事森林生态系统碳、氮循环与全球变化关系的研究，包括土壤有机碳转化规律与碳平衡关系、氮硝化和反硝化与氮氧化物排放、生态系统碳氮循环过程模拟等。2003年以来先后主持国家自然科学基金、福建省科技厅科国际科技合作重点项目、福建省自然科学基金等项目5项，参加国家及省部级、重点和面上项目10余项，具有丰富的科研经验。能顺利指导本人完成该科研工作。

（二）开展项目研究的软硬件条件，尚缺少的条件及解决方法。

项目研究依托福建省湿润亚热带山地生态重点实验室，该实验室今年已经列为科技部 省部共建国家重点实验室培育基地。该实验室拥有2000万元仪器设备，有气相色谱仪、全自动凯氏定氮系统、CHNOS元素分析仪、HighTOCII+N、同位素质谱仪、连续流动分析仪、原子吸收分光光度计、紫外可见分光光度计、土壤粒径分析系统等一批国际先进的仪器和设备，可以满足项目的野外观测和室内分析需要。其实验设备先进、完善，给本文研究提供了较好的实验条件。本文实验需要用到的大型仪器都已具备，同时本校图书馆及数字检索中心的开放、地理科学学院有着丰富的生态专业书刊资料为我们查询相关资料提供了更方便的服务。

（一）技术路线和拟解决的关键问题

技术路线：1、建立一个考虑了预合成酶和新合成酶媒介过程分开的N₂O产生和消耗概念模型；2、培养实验测定土壤反硝化序列产物浓度；3、概念模型参数化；4、模型的敏感性和不确定性分析；5、模型有效性验证。

关键问题：1、预合成酶和新合成酶媒介过程的数学表达；2、参数化（标定）和有效性验证。

（二）实施方案、具体实施计划（含项目研究进度安排）及可行性分析

1、取样

用直径为1.27厘米cm的不锈钢取样器于阔叶林和针叶林土壤中采集土壤样本，并将其分成四个深度增量(即0−5、5−10、10−15和15−25 cm)，土壤核心部分储存在15ml的无菌塑料管中。

2、预处理

在分析土壤pH、NO₃⁻之前，对土壤样品剖面的亚样品进行了过筛(4mm)。可提取有机碳[即溶解有机碳(DOC)]和土壤微生物生物量碳(SMBC)。采用1：1浆液法测定土壤悬浮液中的pH值，用硫酸钾提取DOC和可溶性氮，用总有机碳(TOC)分析仪进行分析和快速流动分析仪分析。用氯仿−甲醇和甲基化法从冻土中提取脂质^[6][7]。采用火焰离子化检测的高分辨率气相色谱法对土壤磷脂脂肪酸PLFA进行定量分析。SMBC的计算基于与土壤磷脂脂肪酸(PLFA)含量的以下相关性^[8]：SMBC=4.5PLFAT+33 (R2=0.85)

3、土壤培养

在含有5ml人工雨水的40ml毫升琥珀瓶中，装入土壤(3g)，用带三通阀塞子进行密封。培养前平均体积空气含量在40%-50%（V：V）之间。根据年降水量的平均浓度，确定了合成雨水中化学成分的含量。将空气从小瓶顶空中排出30 min，用氦(He)代替，共3次，使顶空氧分压降至1%以下(v/v)以下。氯霉素(CHL，2.5g L−1)处理用于抑制蛋白质合成和评估前脱氮酶的活性。为了抑制将N₂O还原为N₂的N₂OR活性，将3.5mL He从顶空除去，用乙炔(C₂H₂)代替，使顶空浓度达到10%(v/v)。同时加入CHL和C₂H₂，测定合成前N₂OR的活性。不同处理的小瓶一式三份，在25℃下培养，然后在旋转摇瓶(250rpm)上轻轻搅拌48h小时。在0，3，6，12，24，36和48h取样每个小瓶的顶空，以配合降雨模拟研究的抽样计划。将顶空样品注入1mL不锈钢样品环，连接到高分辨率气相色谱仪上游的双位置六端口阀上。

4、模型开发

该模型通过包含一个酶活性函数来表示每个序贯反硝化反应的酶动力学，该函数模拟了活性酶池的大小随波动的变化。酶的速率活化假定遵循Michaelis−Menten动力学，如下所示

dER/dt=Vmax,R[Ci/Ke,i·KI，R/(KI，R+CO2)]·（1-ER）

其中ER是酶的活性函数，Vmax，R是相应还原酶反应的最大比合成/活化速率(h−1)。对于酶诱导(M)，Ke是酶诱导的半饱和常数。Ci是底物的水相浓度(M)。R是还原酶(即NAR、NIR、NOR和N₂OR)。而I是相应的底物(NO₃⁻，NO₂⁻，NO，N₂O)。E值从0到1，其中0表示没有活性酶，1表示完全激活酶池。KE，I和KI,R的估计是基于反硝化酶的性质及其对O₂水平的敏感性。为了补偿O₂的强抑制作用，给N₂OR的O₂抑制系数分配了一个低Ki值。在缺氧和理想底物浓度条件下，E值为1。在次优条件下，E的初始估计和酶合成的时间变化是参数。控制酶活性的酶。

用Mandola软件对微分方程组进行了数值求解。初始条件根据培养过程中测量到的水平，包括O₂、NO₃⁻、doc和smbc的浓度以及培养前预合成酶的活性对其进行分类。采用Levenberg−Marquardt方法对模型中的参数进行了优化，通过计算确定系数a来评价模型的适应度。

R2=1-[∑(Cexp-Cmodel)2/∑(Cexp-C(——)exp）2其中Cexp和C模型分别被实验确定和模型模拟浓度(M)。

参考文献：

[1] Hofmann D J, Butler J H, Dlugokencky E J, et al. The role of carbon dioxide in climate forcing from 1979–2004: Introduction of the Annual Greenhouse Gas Index. Tellus Series B-chemical and Physical Meteorology, 2006, 58(5):614–619.

[2] Syakila A and Kroeze C. The global nitrous oxide budget revisited. Greenhouse Gas Meas. Manage. 2011, 1(1): 17-26.

[3] Betlach, M. R.; Tiedje, J. M. Kinetic explanation for accumulation of nitrite, nitric oxide, and nitrous oxide during bacterial denitrification.Appl. Environ. Microbiol. 1981, 42, 1074−1084.

[4] Dendooven, L.; Anderson, J. M. Use of a “least square”optimization procedure to estimate enzyme characteristics and substrate affinities in the denitrification reactions in soil. Soil Biol. Biochem. 1995, 27, 1261−1270.

[5] Pan, Y.; Ni, B.-J.; Yuan, Z. Modeling electron competition among nitrogen oxides reduction and N2O accumulation in denitrification. Environ. Sci. Technol. 2013, 47, 11083−11091.

[6] Leckie, S. E.; Prescott, C. E.; Grayston, S. J.; Neufeld, J. D.; Mohn, W. W. Comparison of chloroform fumigation−extraction, phospholipid fatty acid, and DNA methods to determine microbial biomass in forest humus. Soil Biol. Biochem. 2004, 36, 529−532.

[7] Bailey, V. L.; Peacock, A. D.; Smith, J. L.; Bolton, H., Jr. Relationships between soil microbial biomass determined by chloroform fumigation−extraction, substrate-induced respiration, and phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 2002, 34, 1385−1389.

[8] Zheng, J. Denitrification in soils: From genes to environmental outcomes. Ph.D. Dissertation, Michigan Technological University, Houghton, MI, 2014.

具体实施计划（含年度进展情况）

2019年6月—2019年7月：

   收集资料，阅读文献，明确研究方向，完善实验方案并完成预实验。

2019年7月—2019年8月：

   每月开展试验，获取数据，时刻关注国内外研究进展，并在此过程中不断完善实验方案。

2019年12月—2020年1月：

   整理数据及相关资料，总结实验过程中遇到的问题，向有关老师请教。

2020年2月—2020年3月：

   根据实验结果以及整理收集的资料，明确论文基本框架，撰写论文并进行修改，然后提交论文，准备结题。

可行性分析

(1) 项目组成员为生态学专业学生，有扎实的专业基础知识，参加过一定的科研培训，具有很强的专业仪器操作能力、实验观察能力和数据分析能力。

(2) 已经阅读大量相关文献，了解实验理论以及整个项目的工作流程，进行了合理安排，能在规定时间内顺利完成实验。

(3) 生态基础实验室设备齐全，能够满足研究需要。

(4) 本研究的实验设计及方法是在导师的指导下完成的，可行性较高。指导教师具有非常丰富的前期研究基础，能够提供有效指导。

（三）项目预期的成果和效果（包括成果形式、数量、实施范围、受益学生数等）

预期成果统计：

1.□著作        （   ）部；  2.R研究报告  （  1 ）份 ；

3.□研究论文    （   ）篇 ； 4.□软件      （   ）个；

5.□设计        （   ）份；  6.□实物      （   ）件 ；

7.□获得专利    （   ）份；  8.□获得著作权（   ）份 ；

9.□获奖证书    （   ）份； 10.□其他      （   ）件，                  。

成果简介：

(包括学院对项目建设的政策、人员、经费等保障措施)

1、生态学专业实行导师制，由高级职称的教授、副教授以及具有博士学位的青年教师担任导师。学生能够在大学期间参与导师的课题研究并得到较好的科研训练。

2、图书馆及数字检索中心的开放、地理科学学院有着丰富的生态专业和地理专业书刊资料为我们查询相关资料提供了更方便的服务。

3、项目组成员都为生态学专业学生，具有丰富的生态学知识和基础实验经验，为实验的开展提供保证。

4、项目的申请过程中，项目组成员对选题、研究方案和实施计划进行过多次的讨论，并广泛咨询本专业相关指导老师的建议，为本项目的顺利实施提供了前提保障；项目组成员品学兼优，对申报项目的研究内容有浓厚的兴趣和热情，项目组成员间既有分工又有协作，能够共同完成项目的研究内容，为项目的顺利实施提供了人力资源和组织保障；项目实施计划充分考虑了对节假日和其他课余时间的利用，为项目的顺利完成提供了时间保障。

5、严格按照财务制度及经费预算安排经费支出，保证按时保质保量完成项目研究