一、研究题目：猪肾冷冻复苏的研究

二、研究的目的意义：掌握大体积器官玻璃化冷冻复苏技术，为人类肾脏的玻璃化冷冻复苏以及人体冷冻复苏建立技术基础。这个网址几乎回答了所有你能想到的关于人体冷冻复苏技术疑问：

https://www.alcor.org/FAQs/index.html

64位科学家签署了关于人体冷冻的公开信：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA4ODMzNDc2Nw==&mid=207709133&idx=1&sn=93c705fced4b186328ec26494f21fbf2&scene=18&xtrack=1#rd.（中文）

https://www.biostasis.com/scientists-open-letter-on-cryonics/（英文）

三、研究项目当前的研究现状

我用6点来概括这类研究遇到的瓶颈：

1.控制过度结冰

2.将冷冻保护剂毒性保持在可接受的水平

3.极限不成比例的机械/热力学应力

4.控制低温对人体的过度伤害

5.避免不可接受的缺血性损伤

6.确保可接受的恢复和修复的方法

解决方法（方法序号和问题序号一一对应）：

1.细胞体积减少的综合抗性稳定磷脂双层，抑制胞内冰：采用两步方法提高细胞存活率的创新策略：首先用自然激发的化合物(特别是3-OMG)启动细胞，然后在较低、毒性较低的温度下使用经典的CPA。

用非牛顿流体冷冻保护剂，允许提高冷冻保护剂的浓度，从而控制了过度结冰。

（参考文献：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6558330/#B186）

2.用X-therma的冷冻保护剂XT-ViVo™，根据X-therma官网介绍，这种保存方案是无毒和超有效的，它的效果是普通保存方案的500倍；

3.用纳米加热技术，这种技术有利于加热的均匀，避免热应力损伤（参考文献：https://stm.sciencemag.org/content/9/379/eaah4586）；

4.（暂无方案）

5.研发非牛顿流体冷冻保护剂，可以提高灌注效率，减少缺血性损伤。

方案1：积极抑制代谢率减少缺血损伤

材料：2-脱氧葡萄糖，5-AMP，硫化氢，葡萄糖类似物3-OMG

方案2：尽量减少冻伤

方案内容：增强压力耐受性是大多数自然发生的代谢率下降的基本特征。

保存细胞大分子特别重要，因为替换损坏的大分子的能力降低了。

在冷冻状态转换过程中保持细胞完整性，避免IR损伤。

参考文献：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6558330/#B186

6.补充必须营养因子，积极影响细胞信号通路。

参考文献：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6558330/#B186

四、研究的内容框架

(一)研究单位信息

1.承担单位    江苏逆衰老生物科技有限公司（未注册）

2.课题负责人    陈少颖 

3.主持部门   指进行招标的主要负责单位。

4.起止年月   待议

5.通讯地址： 江阴

6.电话码： 183-8605-3427

7.E-mail地址： 暂未注册企业邮箱

8.申请日期: 2019年8月24日

由于课题来源的途径不同，侧重点也不完全相同相似。但任何一份科研计划书都应包括以下部分的内容。

（二）立题依据

⒈项目的研究意义    

①器官保存时间短，限制了移植，导致器官短缺，加重了移植排斥反应，限制了移植受者的生命周期和质量。

②除了它们在帮助解决器官短缺方面的作用外，器官银行的进展还将大大扩大供受者匹配的选择和公平分配；

③加强对传染性疾病和恶性肿瘤的筛查减少费用和灵活安排手术时间并允许在移植前评估器官质量。

④先进的器官保存方式甚至可以为先进的移植前干预提供机会，从而有可能改善移植结果，包括免疫调节或基因治疗和其他功能增强办法在专门实验室。

⑤重要的是，将器官保存时间延长至5-7天，可使目前的临床免疫耐受诱导方案，在几个中心显示出活体肾脏捐赠的希望。

⑥用于已故器官捐赠-减少或消除终生免疫抑制的需要，从而改善移植受者的生活，并为美国的医疗保健系统节省大约每年1亿美元的免疫抑制费用。组织器官低温保存的研究得到了美国国立卫生研究院、国防部、美国肝病研究协会、美国肾脏患者协会、美国组织银行协会、美国肝脏协会基础、美国儿科肾病学会、美国移植协会、美国肾学会的支持。

⑦我国的器官移植技术得到了国家自然科学基金委员会（NSFC）、中国器官移植发展基金会的资助。

最近，开发新的器官保存方法的目标已成为美国日益增加的国家优先事项。由于认识到生物医学的主要领域，包括组织工程、创伤护理、输血医学和生物医学研究，共同面临保护挑战。

⑧器官冷冻复苏技术的实现必将为人体低温休眠奠定技术基础，有利于各国的太空移民计划的实施。

⑨器官冷冻复苏技术对于实现永生的意义：几乎所有中国人都会在平均寿命75岁左右因病离世，远远没有达到海弗利克极限120岁，目前阻止人类永生的第一道障碍是疾病而不是海弗利克极限，所有疾病的治疗方案都只能拖延时间。根除疾病的唯一方案就是冷冻起来等待未来科技。

⒉生存的主要问题   

①用医美和产品本身创造现金流维持研究；

②增资扩股维持研究。

（三）研究方案

⒈研究目标   冷冻复苏猪肾

⒉研究内容   

⑴研究现场的选择：研究计划书中应该把进行研究的现场写清楚。包括选择研究现场的标准，研究现场所具备的条件以及研究基础。研究现场可以是医院，可以是社区，也可以是有一定组织的机关和厂矿。

⑵研究对象的选择：

①材料来源： 江阴市新港生猪屠宰场

②材料选择的标准：排除有传染病的猪肾 

⑶样本量：暂定100个

⑷研究对象抽取与分配方法：使用随机化的方法抽取研究对象

研究进程的监督和研究质量控制： 暂无

3.研究技术路线：根据不同的项目阶段应用：生物技术，医疗技术，纳米技术，

机械工程技术，单片机开发技术。

4.可行性分析    我们有药理学博士，化学博士，分子生物学博士，非牛顿流体研发人员。而且我坚信任何复杂的问题都能分解成一个个力所能及的小问题。

5.项目的创新之处    专门挑概念型的研究方法，既然传统的方法很难有突破，不如多做一些尝试。第一期：新型冷冻保护剂的研发，我们就是采用在医学应用上还未得到大规模研究的非牛顿流体剪切增稠原理。

6.年度研究计划及预测进展    

准备阶段：

用1年的时间准备。

实施阶段：

A计划：在未寻求到合作伙伴的情况下：

第一期：用3年实现新型冷冻保护剂的研发，在控制冷冻损伤方面达到突破性的成果；

第二期：用3年实现新型冷冻设备的研发，可以更快速地注入冷冻保护剂，减少缺血性损伤；

第三期：用3年解决冷冻带来的过度损伤；

第四期：用3年开发复温设备，做到均匀的复温，减少热应力损伤；

第五期：用3年开发出可接受的修复损伤的方法。

//由于灌注设备、复温设备，修复损伤的方法会随着时间的推进更新迭代，而我们需要升级最先进的设备或方法，所以二-五期的研究计划必须在非牛顿流体冷冻保护剂研发完成之后才能制定。

B计划：在能够建立合作关系的情况下：

用两周的时间研发出先进的冷冻保护剂或者展现出研究保护剂的能力，然后与165家开展器官移植项目的医院寻求合作。医院名单链接：http://www.360doc.com/content/18/0109/13/50051536_720488378.shtml

论文撰写阶段：

用一个月完成论文的撰写。

（三）研究基础

注：未填写价格的设备是未来可能需要但暂时不需要的设备。

                                     实验设备及耗材总计：17287.68元

②已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径；

③申请者和项目组成员的学历的研究简历，已发表的与本项目有关的论文论著，已获得的学术奖励情况以及在本项目中承担的任务等。

⒊研究方法   

第一期：新型冷冻保护剂的研发

（1）非牛顿流体冷冻保护剂的研发

研发原因：灌注期间降低灌注压力使保护剂黏度降低从而提高灌注效率，减少缺血性损伤。

思路：先制备HES，然后将HES与M22混合。

①制备HES：

HES（Sigma，H6382），来自小麦的淀粉（Sigma，S5127）和来自大米的淀粉（Sigma，S7260）。所有样品液均在室温（22 ℃）下新鲜制备，并在使用前用磁力搅拌器充分混合至少10分钟以确保均匀性。

注：新鲜制备样品并在混合后10分钟内使用以防止材料分离，并确保在恒定或变化的剪切下与任何测试材料没有时间依赖性。在扫描期间（每次测量10秒）或在相同剪切速率下的单独测量之间没有看到滞后现象。

②混合HES和M22

按HES:50%,水：10%，M22:10%混合，制备非牛顿流体冷冻保护剂。

③黏度测量设备Anton Paar的使用方法：变仪与DG 42双同心圆柱连接，建立粘度使用旋转流变仪。该系统由两个同心圆筒组成，在两者之间放置一个被测试的混合物，在这个组合中，插入第三个圆柱体并以一定的速度旋转，产生特定的剪切，（每个间隙宽1.2mm，所有测量值一致），可在0-180℃范围内操作。为了测量粘度，按照2.3节分别制备12ml每种样品液。 完全混合后，将流体加入流变仪中。 然后流变仪将在所关注的剪切速率范围内旋转。 使用Rheocompass软件（Anton Paar，St.Albans，UK）记录粘度读数，其基于剪切速率和测量的汽缸壁上的旋转摩擦计算粘度。 所有测量重复三次，扫描并扫描以确保精确度。

通过实验噪声标准偏差超过10％的任何数据被重复进行额外扫描以减少不确定性。

④记录温度的方法：

T型热电偶用于记录温度。 将它们连接到picologger单元（Picotechnology，St。Neots，UK），并使用picologger软件（Picotechnology，St.Neots，UK）记录温度。对于数据，添加了最佳拟合线，所使用的方法在 图传说。

⑤非环境温度下的温度测量：

在冷却前，将T型热电偶添加到粘度计测量附件的内壁和外墙。采用美国马里兰州瓦尔塔姆市的Neslab冷循环系统，以防冻剂(三QX蓝防冻剂)为工质，制备了变温浴。目标温度由放置在浴缸中的热电偶确认。在流变仪的测量附件中放置一种样品流体，并将其降至变温浴中。

温度读数作为圆柱体的温度平衡，直到达到目标温度。然后进行流变读数，同时确保不发生温度变化。

显微术：

样品的制备和放置在两个显微镜盖纸片之间。图像用奥林巴斯BX 51显微镜拍摄，放大倍数为10倍，配有CCD摄像机。

参考文献：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/.articles/PMC6558330/#B186

最终验证：

实现猪肾冷冻复苏。

(四)经费计算

//研究人员工资未知和实验室改装费用未知所以目前无法做经费预算。

实验设备及耗材总计：17287.68元

（五）其他内容

在项目申请书的最后，还有一些其他的项目，包括申请者的承诺、专家推荐意见，以及申请者单位和合作单位审查意见等。

当这些项目都写清楚或填写完成后，一份完整的医学科研计划书或项目申请书就告完成。